频繁复发肾病综合征患儿PD-L1+B细胞比例及意义研究*

石梦月,关凤军

徐州医科大学附属医院儿科,江苏徐州 221000

原发性肾病综合征(PNS)为儿童最常见的肾小球疾病之一。该疾病的一线用药为糖皮质激素,通常大多数患儿初次治疗对糖皮质激素(GC)敏感,但约90%患儿出现复发,其中半数患儿出现频繁复发,称为频繁复发肾脏综合征(FRNS)[1],这部分患儿即使加用免疫制剂疗效仍欠佳,且频繁复发会影响患儿肾脏功能及预后。FRNS的发病机制目前尚不清楚。既往研究多认为,FRNS的发病机制与T细胞亚群紊乱及致病T细胞因子[2]升高有关。近年来,随着B淋巴细胞耗竭剂利妥昔单抗(rituximab,RTX)在PNS中的成功应用,研究者发现其可有效地降低疾病复发频次,这提示B细胞免疫可能在FPNS的病理生理学中起关键作用[3]。

调节性B细胞(Bregs)是一群具有免疫抑制作用的B淋巴细胞亚群,其通过分泌负性细胞因子[如白细胞介素(IL)-10]和靶细胞膜表面分子[如程序性死亡蛋白配体1(PD-L1)]的相互作用发挥抑制作用[4]。Bregs已被证明与多种炎症和自身免疫性疾病相关[4]。过渡性B细胞(CD19+CD24hiCD38hi)和记忆性B细胞(CD19+CD24hiCD27+)是在人类外周血中已被证明的两大富含Bregs的B细胞亚群[4]。LI 等[5]在糖尿病肾病患者中发现,循环CD19+CD24hiCD38hiB细胞数与肾小球滤过率(eGFR)和血清IL-10水平呈正相关,与肾病患者尿蛋白水平呈负相关。研究显示,在过敏性紫癜肾炎(HSPN)患者中,仅在患有蛋白尿或大量蛋白尿的HSPN患者中CD19+CD24hiCD27+B细胞比例降低[6]。以上研究提示这两大B细胞亚群参与了肾小球疾病发生发展。

CD19+PD-L1+B细胞可以通过膜表面分子PD-L1直接与免疫细胞相互作用,在类风湿关节炎(RA)[7]、感染[8]及癌症[9]等疾病中发挥抑制T细胞免疫作用。然而,GRYWALSKA等[10]研究表明,PD-1、PD-L1+T细胞及B细胞在原发性增殖性(PGN)和非增殖性肾小球肾炎(NPGN)中均显著上升,参与疾病炎症状态,提示CD19+PD-L1+B细胞可能参与肾小球疾病的免疫损伤。目前FRNS患儿中CD19+PD-L1+B细胞变化情况尚不清楚。本研究通过流式细胞术检测患儿外周血CD19+CD24hiCD38hiB细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞、CD19+PD-L1+B细胞比例,探讨FRNS患儿的可能发病机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2021年4月至2022年2月在本院确诊的68例(男48例,女20例)初发激素敏感PNS患儿作为研究组,年龄1.5～14.0岁,平均(7.33±3.44)岁。另选取同期在本院体检健康的28例(男20例,女8例)儿童作为健康对照组,年龄为1.5～14.0岁,平均(6.83±3.73)岁。

研究组PNS诊断符合中华医学会儿科学分会2016 年发布的《儿童激素敏感、复发/依赖肾病综合征诊治循证指南(2016)》[11]的标准:(1)大量蛋白尿,即24 h尿蛋白定量(UCFP)≥50 mg/kg,或晨尿的尿蛋白/肌酐(mg/mg)≥2.0,1周内3次晨尿蛋白定性为+++～++++;(2)低蛋白血症,血浆白蛋白<25 g/L;(3)高脂血症,即血清胆固醇高于5.7 mmol/L;(4)存在不同程度水肿。以上4项中(1)和(2)为PNS诊断的必要条件。排除标准:(1)未复发、使用免疫制剂患儿;(2)存在感染、免疫性疾病、内分泌疾病及恶性肿瘤等继发性因素患儿。

研究组患儿门诊定期随访1年,根据复发频次分为FRNS组(31例)和NFRNS组(37例)。非频繁复发肾病综合征(NFRNS):首次完全缓解后6个月内复发1次,或1年内复发1～3次。频繁复发肾病综合征(FRNS):经GC标准疗程治疗后缓解,但病程中半年内复发≥2次,或1年内复发≥4次。

各组儿童性别、年龄、体重等基本资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。所有研究对象均签署知情同意书,本研究经徐州医科大学附属医院伦理委员会审批通过(审批号:XYFY2022-KL136-01)。

表1 各组儿童基本资料比较

1.2主要试剂与仪器 BV650标记的抗人CD19抗体、APC标记的抗人CD24抗体、FITC标记的抗人CD27单克隆抗体、Percp-Cy5.5标记的抗人CD38抗体、BV421标记的抗人CD274抗体(Biolegend公司),LSRFortessaTM型流式细胞仪(美国 BD Biosciences)FACSDvia流式细胞分析软件(美国 BD Biosciences)。

1.3治疗方法及疗效判定 所有研究组患儿均给予诱导缓解及巩固维持治疗,并在GC治疗前和治疗后缓解期(即治疗后4周)采集血液标本。初次发病时均给予醋酸泼尼松片(江苏恒瑞制药有限公司,批号:200226)2 mg/(kg·d),分3次口服治疗,正规减量。疗效判定:完全缓解以血生化、尿检完全正常为标准。PNS复发的诊断标准:停药后连续3 d,UCFP≥50 mg/kg,或晨尿的尿蛋白/肌酐(mg/mg)≥2.0,或晨尿的尿蛋白由阴性转为+++～++++。

1.4检测方法 于健康对照组儿童体检时及研究组患儿GC治疗前和治疗后缓解期抽取清晨空腹静脉血2 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。采用密度梯度离心法分离单个核细胞,2 500 r/min离心弃上清,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后,再用PBS重悬细胞,调整浓度为1×106/mL,吸取100 μL,加入CD19-BV650、CD24-APC-Cy7、CD38-Percp-Cy5.5、CD27-FITC、CD274-BV421各1 μL混匀。每个对照管加入抗APC、FITC、BV650、BV421标记的同型抗体,室温避光孵育15～30 min后加入红细胞裂解液混匀静置15 min,后加入2 mL PBS洗涤,2 500 r/min离心弃上清,再加2 mL PBS洗涤1次,弃上清,于流式细胞仪检测并用Cell Quest软件进行分析。

1.5临床数据收集 收集各组儿童血清白蛋白(ALB)、UCFP、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、总B(CD19+B)细胞计数及免疫球蛋白IgG、IgM水平等临床数据。

2 结 果

2.1各组儿童临床数据比较 GC治疗前,与健康对照组比较,FRNS组、NFRNS组CD19+B细胞、IgM及UCFP升高,ALB、IgG降低,差异有统计学意义(P<0.05);FRNS组较NFRNS组的CD19+B细胞计数和IgM明显升高,ALB、IgG明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。GC治疗后,与健康对照组比较,FRNS组、NFRNS组的CD19+B细胞、IgM、IgG、Scr、BUN、ALB及UCFP变化差异均无统计学意义(P>0.05);FRNS组、NFRNS组CD19+B细胞、IgM及UCFP均较同组治疗前明显下降,ALB、IgG均较同组治疗前明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),Scr、BUN与同组治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组儿童临床数据比较或M(P25,P75)]

2.2两组患儿B淋巴细胞比例情况比较 GC治疗前,与健康对照组比较,FRNS组、NFRNS组患儿外周血PD-L1hiB细胞比例明显升高,CD19+CD24hiCD27+B细胞比例明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);FRNS组较NFRNS组患儿外周血PD-L1hi B细胞比例升高更为明显,CD19+CD24hiCD27+B细胞比例降低更为明显,差异均有统计学意义(P<0.05)。GC治疗后,FRNS组患儿外周血PD-L1hiB细胞比例仍高于健康对照组,且FRNS组仍高于NFRNS组,差异有统计学意义(P<0.05);NFRNS组与健康对照组PD-L1hiB细胞比例差异无统计学意义(P>0.05);各组CD19+CD24hiCD27+B细胞比例比较,差异无统计学意义(P>0.05);FRNS组、NFRNS组患儿外周血PD-L1hiB细胞比例均较同组治疗前明显下降,CD19+CD24hiCD27+B细胞比例均较同组治疗前明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。CD19+CD24hiCD38hiB细胞比例在各组各时期变化差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组儿童各B淋巴细胞亚群水平比较

2.3FRNS组PD-L1+B细胞、CD19+CD24hiCD27+B细胞与临床数据的相关性分析 GC治疗前:FRNS组PD-L1+B细胞比例与CD19+B细胞计数(r=0.528,P=0.002)、IgM(r=0.371,P=0.040)呈正相关,与ALB(r=-0.461,P=0.009)呈负相关,而与IgG无相关性(r=-0.124、0.208,均P>0.05);FRNS组CD19+CD24hiCD27+B细胞比例与IgM、ALB、IgG、CD19+B细胞计数无相关性(r=0.189、-0.120、-0.169、-0.149,均P>0.05)。GC治疗后:FRNS组PD-L1+B细胞比例与CD19+B细胞计数(r=0.437,P=0.014)、IgM(r=0.562,P=0.001)呈正相关,而与ALB、IgG无相关性(r=-0.342、-0.124,均P>0.05);FRNS组CD19+CD24hiCD27+B细胞比例与IgM、ALB、IgG、CD19+B细胞计数无相关性(r=0.163、0.063、0.142、-0.241,均P>0.05)。见图1、2。

图1 治疗前PD-L1+B细胞与CD19+B细胞及血清ALB、IgM的相关性分析

图2 治疗后PD-L1+B细胞与CD19+B细胞及IgM的相关性分析

3 讨 论

FRNS是PNS患儿常见的临床类型之一,属于难治性肾病范畴,其病因未知。足细胞免疫损伤是该病中心环节。多项报道发现,FRNS的发病机制可能与T细胞相关分子的异常有关[2,12]。值得注意的是,PNS患者外周血中免疫球蛋白的异常变化,以及作用于B细胞的免疫抑制剂在该病中所显现的疗效,均提示B细胞参与了PNS的发病[13-14]。CHAN等[3]研究从B细胞耗竭剂RTX治疗FRNS中观察到了肯定的疗效,进一步证实了B细胞参与PNS的发病及频繁复发过程。因此,围绕B细胞的免疫疗法已成为FRNS的治疗选择。然而,RTX足量疗程治疗后长期随访发现仍有部分患儿出现复发,这些患儿后期仍需要免疫制剂及重复RTX疗程治疗[15]。因此,本课题组探讨FRNS的病理生理学发病机制,以期为FRNS临床诊断及治疗提供新的思路。

本研究结果显示,FRNS组及NFRNS组患儿在疾病活动期总B细胞绝对计数显著高于健康对照组,且FRNS组明显高于NFRNS组,经GC有效治疗后的缓解期降低,这与以往报道[16-17]一致,提示FRNS患儿存在B淋巴细胞的异常扩增状态。KIM 等[18]通过实验小鼠模型研究表明,在肾小球局部激活的分泌 IL-4 的 B 细胞可以诱导足细胞消失和蛋白尿。临床观察表明,总B淋巴细胞的清除及恢复并不能预测PNS患儿疾病的缓解及复发,RUGGENENTI等[19]对膜性肾病的研究结果同样表明,循环总B淋巴细胞可能不是FRNS中扩增的特异性B细胞。因此,需要进一步探究不同B淋巴细胞的功能分型在FRNS中的可能作用机制。

本研究显示,FRNS组及NFRNS患儿CD19+CD24hiCD27+B细胞比例较健康对照组减低,且FRNS组低于NFRNS组患儿,GC有效治疗后升高,与阳海平[20]报道基本一致。XIONG等[21]研究发现,活动性SLE患者的CD19+CD24hiCD27+B细胞亚群减少,并且与疾病活动相关。过敏性紫癜肾炎患者外周血CD24hiCD27+B细胞比例降低,且只有在伴血尿、大量蛋白尿的患者中降低[6]。此外,在接受肾移植患者中曾观察到CD19+CD24hiCD27+B细胞比例显著增加,延长了肾移植患者的存活时间[22]。阳海平[20]研究显示,PNS患儿外周血中的CD19+CD24hiCD27+B细胞具有调控Th17/Treg免疫平衡的作用。而Th17分泌的IL-17升高可诱导PNS患儿肾小球足细胞凋亡[23],Treg降低与RTX治疗后MCD患者疾病的早期复发相关[12]。提示CD19+CD24hiCD27+B细胞的功能低下可能与FRNS有关。

本研究显示,GC治疗前,FRNS组、NFRNS组患儿外周血PD-L1+B细胞比例较健康对照组显著上升,且FRNS组明显高于NFRNS组,经过GC治疗后,NFRNS组PD-L1+B细胞下降,但FRNS组PD-L1+B细胞仍高于NFRNS组及健康对照组。这提示PD-L1+B细胞可能在FRNS患儿体内发挥致病作用。GRYWALSKA等[10]也发现,PD-1+、PD-L1+T细胞及B细胞在原发性增殖性(PGN)和非增殖性肾小球肾炎(NPGN)中均显著上升,促进疾病炎症状态;该研究还发现PGN患者T和B细胞上的PD-1和PD-L1表达高于NPGN患者和健康对照组,提示PD-1和PD-L1阳性表达淋巴细胞可能与肾小球疾病的严重程度相关。在系统性红斑狼疮(SLE)中,PD-L1+B细胞的增加与疾病活动指数显著相关,其可以激活致病性T细胞、B细胞应答[24]。但这与以往在癌症等疾病中所表达的抑制机制存在不同[9]。分析可能原因为:部分研究中PD-L1信号可能与PD-1受体结合而发挥抑制T细胞活化作用,而本研究的PD-L1信号可能是通过与一种尚未识别的受体结合发挥激活T细胞作用[25]。由此推断,PD-L1+B细胞的升高可能暗示着B细胞的一种活化状态,在PNS中其可能促进肾小球损伤及疾病频繁复发而不具有调节作用。

低血清ALB是PNS诊断的特征条件之一,也是PNS复发的危险因素。本研究结果显示,FRNS组血清ALB明显低于NFRNS组,相关性分析显示FRNS患儿外周血PD-L1+B细胞比例与血清ALB呈负相关,与PENG等[26]研究基本一致。YU等[27]研究表明,PD-1信号的激活可以损伤肾小球足细胞。由此推测CD19+PD-L1+B细胞可能与肾小球的损伤有关。

IgM在PNS患儿中明显升高,据推测其升高是由于介导IgM合成B细胞发生类型转换的T细胞功能出现缺陷,且致病机制可能是激活了补体级联反应。本研究结果显示,FRNS组血清IgM明显高于NFRNS组,相关性分析显示FRNS患儿外周血PD-L1+B细胞比例与CD19+B细胞和免疫球蛋白IgM呈正相关。近期研究显示,肾脏组织中微量IgM沉积可能是微小肾病综合征患儿糖皮质激素抵抗和频繁复发的重要因素[28]。此外,在某些形式的局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)中观察到肾小球IgM沉积似乎源自IgM(连同活化的补体因子)与肾小球细胞损伤后暴露的表位的结合[29]。这表明 IgM 可能导致疾病进展多于代表致病因素。IgM 可以触发 INS 患者肾小球补体的经典途径[30]。由此推测,PD-L1+B细胞可能参与了PNS患儿的体液免疫反应,可能与患儿IgM分泌的异常有关。

本研究存在一些不足之处,因为PD-L1+B细胞在人类外周血中所占比例极少,所以无法对B细胞上PD-L1表达情况进行分层比较;同时,未能检测全部的PD-1受体及相应的配体表达阳性B细胞比例和下游靶基因;样本量较小,且研究方法简单,未能清楚展示PD-L1+B细胞在PNS中的具体作用机制。因此,仍需要进一步全面研究PD-1+/PD-L1+/PD-L2+B细胞对FRNS疾病的作用,并对这些B细胞进行功能分型。

综上所述,CD19+CD24hiCD27+B细胞及PD-L1+B细胞的异常可能与FRNS有关,但具体机制有待进一步研究。PD-L1信号及其在FRNS中的作用机制极其复杂,有待进一步完善研究该信号在儿童PNS中的发病机制。