共培养诱导乳酸菌细菌素合成的研究进展

满丽莉,向殿军

(1.内蒙古民族大学 生命科学与食品学院,内蒙古 通辽 028042;2.内蒙古民族大学 农学院,内蒙古 通辽 028042)

国家卫生计生委办公厅关于2015年全国食物中毒事件情况通报中显示:28个省(自治区、直辖市)食物中毒事件169起,微生物性食物中毒人数最多,占全年食物中毒总人数的53.7%,主要致病因子为沙门氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及其肠毒素、致泻性大肠埃希氏菌等[1]。乳酸菌细菌素具有来源广泛、安全性高、稳定性好、抑菌谱广等众多优点,作为一种新型的生物防腐剂、添加剂及生产辅助剂而备受青睐,乳酸菌及其细菌素被广泛应用于乳及乳制品(酸乳、干酪)、肉及肉制品(冷鲜肉、香肠、肉干、肉粉肠、熟火腿)、果蔬及其发酵产品(泡菜、腌制白萝卜、酸菜)、调味品(发酵香菇调味制品、酸奶味香精基料)、蛋制品、水产品中,有利于改善食品质量,延长货架期,具有广阔的应用前景[2-11]。乳酸菌细菌素的研究对提升食品安全具有重要意义,有利于抑制食品中常见致病性微生物引发的食物中毒和腐败微生物引起的食品腐败变质[12-17]。

与其他微生物一样,乳酸菌在环境中无处不在,且所处的生存环境多为复杂的多种微生物共存,其生存及各种代谢活动(包括细菌素的合成)很可能依赖于复杂的种间交流和种内交流介导的集体行动,许多研究显示,与特定革兰氏阳性菌共培养可以诱导乳酸菌细菌素的合成,有利于解决目前乳酸菌细菌素由于合成量低而在食品中应用受限的问题,与其他提高乳酸菌细菌合成量的方法(发酵条件及发酵培养基优化、诱变育种、原生质体融合、基因工程)相比较,共培养提高细菌素的合成量具有时间短、设备利用率高、易于操作、成本相对较低等优点,但目前共培养诱导细菌素合成的潜在机制尚不完全明确,共培养诱导乳酸菌细菌素合成的工业应用需要掌握更多的相关理论依据和技术支持[18-23]。基于目前的研究结果,本文论述了共培养中诱导菌与乳酸菌细菌素合成的关系、诱导因子/信号分子的特征、双组分调控系统及共培养诱导乳酸菌细菌素合成的分子机制,以期为实现共培养诱导乳酸菌细菌素合成的工业应用提供理论依据。

1 诱导菌与乳酸菌细菌素合成的关系

1.1 共培养对乳酸菌细菌素合成的影响

共培养对乳酸菌细菌素合成的影响主要体现在三个方面:第一,主要针对具有细菌素合成能力,但没有抑菌活性的乳酸菌,共培养可诱导细菌素的合成,近而产生抑菌活性,例如:LactobacillusplantarumJ23、L.plantarumHE-1[24-25];第二,主要针对可合成细菌素并具有抑菌活性的乳酸菌,共培养可增加细菌素的合成量,例如:L.plantarum1.0391[26]、L.plantarumNMD-17[27]、L.paracaseiHD1.7[28];第三,共培养亦可抑制乳酸菌细菌素的合成,例如:两株细菌素产生菌E.faecium6T1a与L.plantarumNC8C共培养后,细菌素的合成量均受到抑制[29],Piazentin等[30]的研究结果显示,在与LigilactobacillussalivariusATTC 11742和LimosilactobacillusreuteriATCC 23272共培养时,E.faecium135的细菌素合成量受到抑制,可能是碳源竞争所导致的。

1.2 诱导菌与乳酸菌的亲缘关系

诱导菌与细菌素合成乳酸菌可能是亲缘关系较近,亦可能是亲缘关系相当远的菌株,如L.plantarumNC8既可与亲缘关系较近的诱导菌E.faecalisEF1、E.faeciumLP6T1a-20、L.acidophilusNCDO1748、L.brevisLB9、L.bulgaricusATCC 11842、L.fermentumATCC 9338、L.sakeiNCFB 2714、Lactococcuslacticsubsp.cremorisCNRZ163、PediococcuspentosaceousFBB63共培养诱导细菌素的合成,亦可与亲缘关系相对较远的诱导菌BacilluscereusATCC 9139共培养诱导细菌素的合成[31]。L.plantarumHE-1与亲缘关系较近的诱导菌L.fermentum、L.plantarum、Lactococcuslactic和亲缘关系较远的诱导菌Staphylococcusaureus和Bacillussubtilis共培养均可诱导细菌素的合成[25]。

1.3 诱导菌的特异性及抗性

乳酸菌细菌素合成的诱导菌具有特异性,大部分研究者都是将具备细菌素合成能力的乳酸菌与大量的革兰氏阳性菌共培养,从中筛选出提高细菌素合成量的诱导菌,同时诱导菌对细菌素的抗性亦不相同。L.acidophilusLa-5与诱导菌StreptococcusthermophilusSTY-31、L.delbrueckiisubsp.bulgaricusCECT4005、L.delbrueckiisubsp.bulgaricusLBY-27、L.delbrueckiisubsp.lactisCECT282共培养能提高细菌素的合成,前两株诱导菌对Lactacin B具有抗性,而后两株诱导菌对其敏感[32]。L.paracaseiHD1-7与诱导菌B.subtilisATCC11774共培养能提高细菌素的合成,诱导菌对Paracin 1.7敏感[33]。LeuconostoccitreumGJ7与诱导菌L.plantarumKFRI464、L.delbrueckiiKFRI347、LeuconostocmesenteroidesKCTC1628共培养能提高细菌素的合成,诱导菌对Kimchicin G7敏感[34]。L.plantarumJ23与诱导菌L.hilgardiiJ81、L.lactisMG13363、P.pentosaceusFBB63共培养能提高细菌素的合成,L.hilgardiiJ81对L.plantarumJ23所产细菌素具有敏感性,而另两株诱导菌具有抗性[24]。当L.plantarumDC400与诱导菌L.sanfranciscensisDPPMA174、Pediococcuspentosaceus2XA3共培养能提高细菌素的合成,诱导菌对Plantaricin A敏感[35]。

1.4 诱导菌对乳酸菌细菌素合成的影响

1.4.1 诱导菌的存在形式对乳酸菌细菌素合成的影响

大部分研究显示一般活的或经温和热处理的诱导菌能够诱导乳酸菌细菌素合成,也有少数研究发现诱导菌的发酵上清液或死菌菌悬液亦可发挥诱导作用。L.acidophilusLa-5、L.plantarumJ23与诱导菌的活菌、经温和热处理的菌体均能诱导细菌素的合成[32]。L.paracaseiHD1-7与诱导菌的活菌或发酵上清液共培养能提高细菌素的合成[33]。L.plantarumNC8与诱导菌的活菌、经温和热处理的菌体、上清液、死菌菌悬液共培养均能提高细菌素的合成。L.plantarumKLDS1.0391和L.plantarumNMD-17只有与诱导菌的活菌共培养时才能诱导细菌素的合成,而诱导菌的上清液及死菌菌悬液无法诱导细菌素合成[36]。大部分研究结果显示诱导菌的活菌均能诱导乳酸菌细菌素的合成,而发酵上清液或死菌菌悬液对乳酸菌细菌素是否有诱导作用表现不尽相同。

1.4.2 诱导菌对乳酸菌活菌数的影响

共培养后诱导菌会导致细菌素产生乳酸菌的数量呈现不同的变化,诱导菌L.helveticusKLDS1.9207、E.faeciumKLDS4.0352、L.reuteriKLDS1.0737、E.faecalisKLDS4.0313导致L.plantarumKLDS1.0391的活菌数显著增加(P<0.01),L.plantarumNC8、L.plantarumNMD-17表现出一致的结果[37],而与L.plantarumDC400、L.acidophilusNCFM共培养的结果不同,诱导菌L.sanfranciscensisDPPMA174、L.rossiaeA7对L.plantarumDC400活菌数基本无影响(P>0.05),诱导菌L.monocytogenesEGD-e导致L.acidophilusNCFM的活菌数显著降低。同时,L.plantarumKLDS1.0391和L.plantarumNMD-17在与非诱导菌共培养时,其活菌数显著下降(P<0.01),可从一定程度上说明L.plantarumKLDS1.0391和L.plantarumNMD-17细菌素合成量的增加与诱导菌所导致的活菌数增加存在一定的联系[36],符合群体感应定义的密度依赖特征。

2 诱导因子/信号分子的特征

2.1 诱导因子/信号分子的分布及诱导活性

诱导因子/信号分子所处的位置会影响乳酸菌细菌素的合成。一般情况下,活的或经温和热处理的诱导菌能诱导乳酸菌细菌素的合成,而大部分诱导菌的上清液无法发挥诱导作用。经检测发现诱导菌的无细胞上清液中缺少诱导活性可能有两点原因:第一,可能是由于诱导因子/信号分子极少被运输到细胞外,但也存在例外,当L.paracaseiHD1-7、L.plantarumNC8与诱导菌的活菌或上清液共培养后细胞外的诱导因子/信号分子活性增强[33];第二,可能与细胞外环境中AI-2的有效性有关,AI-2的有效性取决于AI-2合成微生物所处的生理状态。高浓度的葡萄糖有利于AI-2在细胞外环境中的积累[37-39],但细胞外环境中的AI-2可能又会被微生物重新摄入细胞内,并作为对数生长期后期所需的碳源[40]。Moslehi-Jenabian等[41]研究发现,L.acidophilusNCFM发生酸休克会显著增加胞外AI-2积累及luxS基因上调。Barefoot等和Tabasco等的研究发现,诱导因子/信号分子可能位于细胞质内或与诱导菌的细胞壁或细胞膜相结合,诱导因子/信号分子与诱导菌的细胞膜结合能显著提高诱导因子的耐热性,但当诱导因子/信号分子被分泌到细胞外时,热处理会导致其诱导活性快速丧失[42]。

2.2 诱导因子/信号分子的诱导机制

2.2.1 通过物理接触实现

诱导因子/信号分子可能以某种方式与细胞相结合,可存在于细胞壁、细胞膜或细胞质上,其转移可通过与共培养菌的物理接触来实现。原核生物中的Ⅳ和Ⅵ类型分泌系统需要细胞与细胞接触来转移大分子,此现象存在于部分革兰氏阳性菌中[43-44],为通过细胞间接触才能转移诱导因子/信号分子提供合理的解释,分泌到胞外的诱导因子/信号分子才可能作为某些细菌素合成相关基因的一种刺激。

2.2.2 通过诱导因子/信号分子的信息交流实现

共培养后诱导菌合成的诱导因子/信号分子仍具有诱导活性,可能是增加乳酸菌细菌素合成量的必要条件。例如,Di Cagno等[45]对L.plantarumDC400细菌素Plantaricin A合成的诱导研究证实了此解释,将L.plantarumDC400与诱导菌的培养物置于两个相连容器中,中间被渗透滤膜分隔开,避免两者的物理接触,但可进行分子间的信息交流,亦可诱导细菌素的合成。

2.2.3 通过受损修复实现

有研究显示,部分轻度热破坏的诱导菌仍可诱导乳酸菌细菌素的合成,原因可能有两点:第一,可能在破坏的细胞碎片中存在未受损的诱导菌菌体;第二,可能是存在亚致死性损伤的诱导菌菌体,当与乳酸菌共培养后会重新处于富含营养的MRS或M17培养基中,亚致死性损伤的诱导菌菌体经修复后,恢复其正常的代谢活动及诱导因子/信号分子的合成、诱导能力。

2.3 诱导因子/信号分子AI-2的功能

诱导因子/信号分子AI-2与共培养诱导细菌素合成密切相关,共培养诱导乳酸菌细菌素合成过程中,AI-2浓度与细菌素的合成量具有同步性,然而,AI-2与细菌素合成之间的直接联系尚未完全建立。luxS基因编码的蛋白是参与AI-2合成的关键酶,luxS基因在不同种属的微生物中具有相对高度的保守性,AI-2通常被认为是不同菌株之间交流的种群间信号分子。例如:与特定的革兰氏阳性菌活菌共培养6～9 h能显著增加L.plantarumKLDS1.0391的细菌素合成量,细菌素的合成量与L.plantarumKLDS1.0391的菌体密度、AI-2浓度呈现正相关性,luxS基因缺失突变菌株共培养后不能诱导细菌素合成量增加,可能原因在于luxS基因缺失突变菌株与诱导菌共培养后,AI-2的浓度未能达到阈值,信号分子无法被识别。AI-2的诱导活性通常见于厚壁菌,如植物乳杆菌[46-47],但乳酸菌属对AI-2的信号输出和接收/转导途径尚未完全明晰,在其他微生物中发现了AI-2的特异性受体,包括LuxP家族、LsrB家族及rbsB基因编码的核糖ABC转运蛋白[48-51]。

共培养中,乳酸菌中AI-2受体对通过群体感应系统诱导Ⅱ类细菌素合成中是必需的。L.plantarumC11、L.plantarumNC8与同一诱导菌L.lactisIL1403共培养均能诱导细菌素的合成,但作为信号分子AI-2受体的组氨酸激酶的结合序列具有显著差异,说明在L.plantarumC11和L.plantarumNC8中可能存在另一共有的AI-2受体,此受体可能是由rbsB基因编码的,因为rbsB基因在许多微生物中广泛存在,并具有作为AI-2受体的潜在功能,从理论上可补充该受体诱导或辅助AI-2依赖型细菌素调控的能力,但还需进一步验证[52]。

3 双组分调控系统

国内外研究显示,与特定乳酸菌共培养诱导细菌素的合成受到群体感应(quorum sensing,QS)系统的调控,QS系统主要包括信号分子和双组分调控系统(TCS)[53-55]。典型的双组分调控系统(TCS)包括位于细胞质膜的组氨酸蛋白激酶(HPK)和位于细胞质中的反应调节蛋白(RR)两部分。HPK作为感受器,能监测环境变化(如共培养菌株的存在),RR具有传递来自感受器的信号和调节基因表达的作用, 可同时调节一个调节子中多个基因的表达[56]。

Lactococcuslactis合成的细菌素Nisin是研究最透彻且已经实现商业化生产的细菌素,Nisin合成是受双组分调控系统Nis K(HPK)和Nis R(RR)所调控的,当两者被破坏时,细菌素将无法正常合成[57]。L.paracaseiHD1.7 合成的细菌素Paracin 1.7受Prc K(HPK)和Prc R(RR)的调控,当与枯草芽孢杆菌ATCC 11774共培养时,L.paracaseiHD1.7所产细菌素为其单独培养的 1.21 倍,群体感应相关基因prcK和prcR分别上调4.98倍及5.41倍。L.plantarum中与细菌素合成相关的双组分调控系统主要包括三类:第一类是L.plantarumC11、WCFS1、J51、V90、ATCC14917、BFE5092、YM-4-3、ST-Ⅲ、ZJ316中的PlnB(HPK)和PlnC(RR)、PlnD(RR),PlnC能激活转录并合成细菌素,而PlnD发挥负调节作用;第二类是L.plantarumJDM1和L.plantarumNMD-17中的PlnB(HPK)和PlnD(RR),而不存在PlnC;第三类是L.plantarumNC8、J23、LZ206、PCS20、UL4、163、KLDS1.0391中的PlNC8HK(HPK)和PlnD(RR)[58-59]。LactobacillussakeiLb706 合成的细菌素Sakacin A受Sap K(HPK)和Sap R(RR)的调控;CarnobacteriumpiscicolaLV17B合成的细菌素Carnobacteriocin B2和Carnobacteriocin BM1受Cbn K(HPK)和Cbn R(RR)的调控;Streptococcussalivarius合成的细菌素salivaricin A受SalK(HPK)和SalR(RR)的调控[60-61]。掌握乳酸菌中与细菌素合成相关的双组分调控系统类型,明确双组分调控系统在乳酸菌细菌素合成中作用,有助于更好地提高细菌素的合成量。

4 共培养诱导乳酸菌细菌素合成的分子机制

4.1 自体诱导机制

共培养诱导L.plantarumNC8细菌素的合成与自体诱导机制密切相关,自体诱导机制需要通过诱导因子plNC8IF、组氨酸蛋白激酶plNC8HK和反应调节蛋白plnD的群体感应调控系统实现[62-63]。L.plantarumC11与L.plantarumNC8中的群体感应调控系统在功能上展现出一定的相似性,其调控系统由细菌素/诱导肽plnA、组氨酸蛋白激酶plnB和两个反应调节蛋白plnC及plnD构成。共培养能同时使L.plantarumNC8中细菌素编码的结构基因plNC8βα及调控系统编码基因发生上调[64-65]。L.plantarumNC8中群体感应调控系统编码基因被敲除,诱导菌的加入将无法诱导突变株细菌素的合成,说明群体感应调控系统是共培养诱导细菌素合成的必要部分。组氨酸蛋白激酶具有N端跨膜结构域,可感知胞外诱导因子的存在,通过磷酸化反应将信号传递给反应调节蛋白,反应调节蛋白结合到细菌素合成相关基因上,近而诱导其表达。同一诱导菌可同时提高L.plantarumNC8和L.plantarumWCFS1的细菌素合成,但两者的组氨酸蛋白激酶序列具有较低的同源性,诱导菌合成的诱导因子无法同时被两种组氨酸蛋白激酶所感知,可能是由于诱导菌可同时产生两种不同的诱导因子,或者乳酸菌中还存在组氨酸蛋白激酶以外的分子作为信号接收器,调控特定的反应调节蛋白,从而激活细菌素合成调控操纵子[52]。

4.2 二级调控机制

L.acidophilusLa-5单独培养时仅能在固体培养基中产生细菌素,而在液体培养基中不能产生细菌素,当与诱导菌共培养时亦可在液体培养基中产生细菌素。L.acidophilusLa-5的细菌素Lactacin B合成可能是由群体感应调控系统和自身启动子(二级调控机制)共同完成的[66]。L.acidophilusLa-5与人工合成的诱导因子IP_1800共培养时发现其细菌素合成是一个剂量依赖的调控过程,诱导因子的添加导致细菌素结构基因lbaB在转录水平上上调,细菌素的合成量增加,表明群体感应系统是细菌素Lactacin B合成的调控机制之一。而L.acidophilusLa-5与诱导菌S.thermophilusSTY-31共培养导致结构基因lbaB、自体诱导因子IP_1800编码基因及ABC转运蛋白编码基因ABC_1796在转录水平上显著上调,结构基因lbaB的上调程度明显高于细菌素Lactacin B合成相关的其他基因,细菌素的合成量增加。转录分析表明细菌素Lactacin B合成相关基因应转录为同一转录本,但这与诱导菌共培养后结构基因上调程度显著高于其他细菌素合成相关基因存在矛盾,根据上述结果推测细菌素结构基因lbaB另外还受自身启动子的调控(二级调控机制),位于细菌素Lactacin B操纵子下游的内在终止子被认为是潜在的lbaB调节因子。因此,共培养的诱导菌可能被L.acidophilusLa-5认为是一种外界刺激,通过其初级或次级代谢产物的产生或与乳酸菌的物理接触,从而激活推测的二级调控机制[32]。

4.3 不同信号分子的联合调控机制

L.plantarumDC400与特定诱导菌L.sanfranciscensisDPPMA174、P.pentosaceus2XA3共培养能显著增加细菌素的合成量,但L.plantarumDC400的生长量和存活率却未受到影响,此过程中L.plantarumDC400产生的细菌素Plantaricin A亦是信号分子,同时L.plantarumDC400中luxS基因的表达量显著上调,运用V.harveyiBB170菌株检测发现共培养后的上清液中信号分子AI-2活性增加,说明共培养对细菌素的诱导作用可能同时受到Plantaricin A和AI-2两种信号分子的调控[45]。

5 结论

乳酸菌细菌素作为天然的功能性防腐剂具有安全、环保、无毒、抑菌谱宽、稳定性强等优点,在食品、调味品中展现出较好的开发前景,新技术、新方法的不断发展和研究给乳酸菌细菌素在食品领域中的应用带来新的机遇[67-69]。乳酸菌与其他菌株共存是在自然环境和发酵食品中常见的现象,大量研究显示与革兰氏阳性菌共培养能诱导乳酸菌的细菌素合成,但由于乳酸菌细菌素合成涉及的合成基因和调控基因、途径的多样性和复杂性等,诱导机理尚未完全清晰。共培养诱导细菌素合成是复杂的生物之间相互作用的过程,要实现其工业化应用需要进一步明确潜在信号分子的鉴定及合成途径、信号分子的接收部位、信号分子的传递途径、细菌素合成相关基因的启动方式、共培养过程中相关基因和蛋白质的转录和表达情况、乳酸菌感知其他微生物存在的方式等诸多问题,应用转录组学、蛋白组学和代谢组学有利于掌握共培养条件下基因、蛋白质表达的整体变化和代谢途径等,有助于识别差异表达的基因和蛋白质,从中挖掘有价值的信息。科学技术的不断发展有助于更加全面和深入地揭示共培养诱导细菌素合成的调控机制,满足消费者对高质量食品的安全性要求。