基于模糊综合评价法对不同部位牦牛肉特征及挥发性化合物成分分析

张浩,邓静,唐英明,陈胜利,乔明峰,白婷,张振宇*

(1.四川旅游学院 烹饪学院,成都 610100;2.四川旅游学院烹饪科学四川省高等学校重点实验室,成都 610100;3.肉类加工四川省重点实验室,成都 610106)

青海地区牦牛主要生长在4 000～4 500 m的高海拔、高山草原地区[1],通过半野化放牧以及畜种改良、优化,目前培育出“野血牦牛”[2]。高原草饲牦牛肉脂肪低,富含蛋白质、氨基酸以及钙、磷等微量元素[3],对提高人体免疫力具有显著作用。高原草饲散养牦牛因其运动机能不同,不同部位的肌肉品质差异明显,需要辨别不同部位化合物成分才能分辨出青海牦牛肉特征和挥发性化合物成分。

目前关于牦牛的研究主要集中在牦牛肉营养成分[4]、品质差异[5]、牦牛饲养[6]、品质及感官特性的影响[7]、微生物多样性[8]、屠宰方法[9]、氨基酸及风味分析[10]等方面。对于挥发性化合物成分分析的相关研究并不多见,特别是对青海玉树地区高原、草饲、野血牦牛肉的化合物成分分析、特征差异等方面的研究非常少。感官评价是评价食品优劣的常见方法[11],但其主观性、嗜好性强,重复性差,而采用模糊综合评价方法(fuzzy comprehensive evaluation method)对感官评价进行定量化和数学化的描述和处理已经在食品的感官评定中得到了广泛应用[12];电子鼻(electronic nose)能模拟人类嗅觉,其检测结果客观、重复性好[13];固相微萃取-气相色谱-质谱联用(SPME-GC-MS)技术是分离、鉴定复杂有机物的技术,主要检测小分子挥发性物质[14],二者数据融合分析可以明确挥发性化合物成分,并分析其相关性和差异性。

本文拟以不同部位牦牛肉为研究对象,采用模糊综合评价进行感官评价,运用电子鼻、SPME-GC-MS、主成分分析、聚类分析、热图分析、相关性分析等方法,分析青海牦牛不同部位肌肉挥发性化合物整体信息,辨别出不同部位牦牛肉化合物成分的相关性与差异性,为今后牦牛肉的风味评价研究提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青海牦牛(由青海圣洁高寒农牧科技有限公司提供的2.5龄牦牛),低温排酸24 h、熟成36 h后,取胴体左侧5个部位肌肉,冷冻后真空包装,运送到实验室,解冻到室温25 ℃。样品具体信息见表1。

表1 青海牦牛肉部位样品分类

FOX4000电子鼻 法国Alpha MOS公司;SQ680气相色谱-质谱联用仪、色谱柱Elite-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美国PerkinElmer公司;75 μm CAR/PDMS手动萃取头 美国Supelco公司;15 mL顶空瓶 北京谱朋科技有限公司;BT423S电子天平 德国赛多利斯公司;其他为实验室常用设备。

1.2 实验方法

1.2.1 感官评价

参考韩冬洁等[15]的模糊综合评判法在牦牛肉感官评定中的应用,制定评分标准,见表2。

表2 鲜牦牛肉感官评分标准

由10位食品感官评价的专业人员组成评定小组,首先对评定人员开展感官培训,包括肉类外表色泽、水分黏度、嗅闻气味和观察肌肉组织的具体方法,对评价结果进行模糊综合评价。模糊综合评价法是应用模糊系统的原理,将原先较模糊的因素进行量化,变为数据,称为去模糊化,再利用多个因素对被评判事物的隶属度等级状况进行综合评判的方法。

1.2.2 电子鼻

样品处理:将牦牛肉剔去筋膜、剁细,精确称量2.00 g样品,放入10 mL顶空进样瓶中,密封,编号待检。

分析条件:顶空温度50 ℃,时间300 s,进样量500 μL/s,数据采集时间120 s,采集延迟180 s。样品测定9组,取3组相对稳定的结果分析。

1.2.3 固相微萃取-气相色谱-质谱联用

参考张爱萍等[16]的方法,样品处理:将牦牛肉剔去筋膜、剁细,精确称量4.00 g 样品,放入20 mL顶空进样瓶中,加入适量饱和纯盐水,密封,编号待检。

萃取条件:取样品于顶空瓶中,在55 ℃恒温水浴30 min,将75 μm CAR/PDMS手动萃取头插入顶空瓶中吸附30 min,将进样针插入GC-MS进样口,解吸600 s。

GC条件:色谱柱Elite-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升温程序:起始温度40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min升至60 ℃,以10 ℃/min升至120 ℃,以15 ℃/min升至250 ℃,保持3 min。载气:氦气(99.999%),流速1 mL/min,分流比10∶1。

MS条件:EI离子源,电子轰击能量70 eV,离子源温度230 ℃,全扫描,质量扫描范围(m/z)30～600;标准调谐文件。

定性、定量分析:挥发性成分归一化定性、定量以检索NIST 2011谱库,计算其保留指数并与其他文献值进行比对,同时结合人工解析质谱图进行确定。

1.3 数据处理

数据处理和分析采用Excel 2007,显著性(P<0.05表示有显著差异)分析采用SPSS 25,作图采用Origin 2021。

2 结果与分析

2.1 感官评价结果

综合评价集V={v1,v2,v3,v4},v1,v2,v3,v4分别代表优、良、中、差;

隶属因素集U={u1,u2,u3,u4},u1,u2,u3,u4分别代表色泽、水分、气味、组织;

因素权重集合模糊集A={ɑ1,ɑ2,ɑ3,ɑ4},ɑ1,ɑ2,ɑ3,ɑ4分别代表肉类感官评价影响程度,最终设定为ɑ1=0.30,ɑ2=0.15,ɑ3=0.20,ɑ4=0.35。

根据模糊综合评价法,进一步构建评价矩阵并计算综合隶属度,根据综合评分进行感官评价[17],根据10个评分人员的综合结果得出表3和5个模糊矩阵。

表3 不同部位牦牛肉模糊评判矩阵

表4 牦牛肉感官评分结果

权重集合:A={0.30,0.15,0.20,0.35},综合评价集V={3,5,7,9};

矩阵运算:R=(Rj×A)/10={1.09,0.955,1.055,0.955,1.08};

R×V={6.5,5.73,6.33,5.73,6.48}。

模糊综合评分结果:{6.5,5.73,6.33,5.73,6.48},得分顺序:样品A>E>C>B=D;其中样品A、E、C(评分在5～7之间,偏向于7;品质在良和中之间,偏向于良)模糊数学评定优于样品B、D(评分在5～7之间,偏向于5;品质偏向于中,且得分相同,品质相似)。

2.2 电子鼻结果分析

电子鼻雷达图见图1。

图1 电子鼻雷达图

由图1可知,LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCT1 和LY2/gCT 传感器信号强度差异不明显,其余12根传感器信号强度差异较明显;样品A在传感器T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2上与其他样品表现出明显差异,完全独立于其他样品。有研究表明,这类感应器对极性化合物、非极性化合物、甲苯、醛类、乙醇较敏感,这可能与样品中含有大量醇类、醛类物质有关[18]。

电子鼻主成分分析图见图2。

图2 电子鼻主成分分析图

由图2可知,PC1贡献率为90.36%,PC2贡献率为6.02%,说明大量有效信息存在于第一主成分。侯婷婷等[19]研究认为,当PC1 贡献率远大于PC2时,说明样品在横坐标上距离越大,其差异性越大,而样品B、C、D均靠近横坐标,其差异性较小,样品E距离横坐标较远,表现出较大差异,样品A位于第三象限,气味独立于其他样品。

电子鼻18根传感器对应的敏感物质类型见表5。

表5 电子鼻18根传感器对应的敏感物质类型

由表5可知,牦牛肉中苯类、醇类、烯烃类、酮类、硫化氢类、乙醇类的信号强度比较明显。

2.3 SPME-GC-MS结果分析

2.3.1 化合物成分分析

青海牦牛肉共鉴定出60种化合物,由表6可知,A、B、C、D、E分别含有45,46,41,40,49种化合物,包含醛类、醇类、烃类、酸类、酮类和杂类含硫、醚类化合物。这些肉类化合物成分是风味前体物质,在后期加工过程中通过美拉德反应、脂质氧化、糖类降解转化为肉类风味物质,其中醛类、酮类、含硫化合物以及杂环类化合物是肉类香气的主要来源。

由表7可知,牦牛肉化合物成分主要包括醛类含量34.86%～53.65%,醇类含量8.91%～23.66%,烃类含量8.39%～35.98%,酸类含量2.64%～8.52%,酮类含量0.36%～2.04%,杂类含硫、醚化合物3.47%～17.92%,可以确定牦牛肉不同部位化合物成分构成差异较大。

表7 牦牛肉化合物相对含量统计表

醛类化合物是肉类重要的香气成分,一般来源于不饱和脂肪酸氧化过程或糖类降解过程[20],对肉类风味的影响较大。由表7可知,牦牛肉醛类化合物相对含量最多,其中样品B醛类(相对含量高达53.65%)是青海牦牛肉主要化合物成分,这与朱青云等[21]得出的醛类是青海牦牛肉中挥发性风味成分的重要组成部分的结论基本相同,且样品B相对样品A醛类含量高出65%左右,表明5个样品醛类含量有差异,B>D>C>E>A。肉类脂肪受热后产生美拉德反应,香味前体物质转化为杂环类化合物、醛类、醇类[22],因此脂肪含量较多的部位,如样品B、D、C,其醛类含量相对较高,而脂肪含量较少的部位,如样品A、E,其醛类含量相对较低,这与电子鼻主成分数据分析结果相似。

醇类化合物主要是由牛肉脂质降解产生的[23],对牛肉风味的形成具有重要作用。滕迪克等[24]的研究结果表明,醇类化合物在肉类整体风味的形成中发挥了关键贡献,样品A中2-乙基-1-己醇是其他样品的3倍,苯甲醇是其他样品的1～2倍,说明样品A与其他样品差异较大。朱青云等[21]研究认为醇类在青海牦牛肉中处于次要地位,主要是因为醇类一般阈值较高。钱敏等[25]研究表明2-乙基-1-己醇含量虽然比较高,但是其香气阈值也高,对风味贡献比较小,而样品A醇类相对含量高出样品C大约265%,表明醇类相对含量差异较大,A>E>D>B>C,说明不同部位牦牛肉醇类特征差异较大。

烃类化合物是肉类氨基酸、脂肪氧化后期产物[26]。曹伟峰等[27]研究认为烃类是在熟牛肉和生牛肉中发现的含量最多的一类挥发性化合物,但是这类化合物的阈值较低,对肉制品风味的贡献并不大。样品C烃类含量是样品E的428%,呈现显著差异,C>A>B>D>E。李永鹏等[28]研究表明,牛肉中像甲苯这样的芳烃气味与涂料味有关,在牦牛肉成熟后会在一定程度上加强,也就是常见的牦牛肉异味。王惠惠等[29]研究认为此类物质可作为醛类、酮类的前体物质,促进肉产品风味的形成。样品E烃类含量显著低于其他样品,嗅闻气味也较清淡,这和前面的感官评价结果相似。

酸类化合物一般由相对应的醛类物质经氧化、还原形成[30];样品E酸类相对含量是样品B的322%,差异显著,但青海牦牛肉前期经过低温排酸,其检测出的相对含量值均较小,对整体牦牛肉化合物成分的影响不大,E>D>C>A>B。

酮类化合物可由脂肪氧化和美拉德反应产生[31];生肉时对风味的影响相对较小,实验只检测出4种(当然也可能是草饲牦牛肉与谷饲牦牛肉脂肪含量差异巨大,作为脂肪氧化后期产物的酮类相对较少),E>D>C>B>A。

杂类含硫、醚化合物对肉类风味起决定作用的是含硫、含氮、杂环类化合物和含羰基化合物[32];样品E相对含量是样品B的516%,表现出巨大差异,且样品E中2-硝基吡啶、2-乙酰吡咯烯丙基甲基硫醚、噻吩、2-乙基呋喃、2-戊基呋喃等相对含量均优于其他部位,特别是2-乙酰吡咯、烯丙基甲基硫醚与其他部位有显著差异;Smith等[33]研究认为2-甲基呋喃浓度低时具有肉香味和坚果香气;许多研究证明牛肉“膻味”的成分之一苯酚[34]在高原草饲牦牛肉中仅检出少量,是青海牦牛肉气味较好的证明;E>A>D>C>B,其中样品E相对含量与其他样品差异显著。

最终分析结果表明不同部位牦牛肉化合物类别差异显著。

2.3.2 主成分分析与聚类分析

对牦牛肉化合物相对含量进行归一化处理,分别做主成分分析图和系统聚类图。由图3可知,PC1贡献率(59.02%)、PC2贡献率(27.21%)两者相加贡献率大于80%,可以代表样品挥发性化合物大部分信息。罗杨等[35]研究认为PCA中样品之间距离近则代表差异小,距离远则代表差异明显。样品B、C位于第二象限,距离相近,化合物成分相似,且相关于醛类、烃类化合物;样品D位于第一象限,显著相关于醛类化合物;样品E靠近X轴,显著相关于酮类、酸类、杂类含硫、醚化合物;样品A显著区别于其他样品,位于第三象限,靠近Y轴,相关于醇类化合物。由图4可知,样品B、C聚类,然后与样品D聚类,样品A、E独立聚类。

图3 牦牛肉挥发性化合物主成分分析图

图4 牦牛肉部位系统聚类图

2.3.3 热图分析

将5个部位挥发性化合物做热图。颜色越深表示相关度较高,颜色越浅表示相关度较低,相关数值在0～1之间,不同颜色区域代表差异较大的部分。由图5可知,一区化合物聚为三类,其中,样品A显著相关于醇类、烃类;样品B、D较相似,显著相关于醛类、醇类;样品C显著相关于烃类,特别是各种含甲苯化合物;样品E负相关于一区的化合物。二区化合物聚为一类,样品A、B、C、D呈现显著负相关,而样品E在这一区域呈现显著相关,特别是杂类含硫、醚类化合物、吡嗪、吡咯。三区化合物聚为两类,样品A、B、C呈现负相关,样品D呈现酸类显著相关,样品E这一区域呈现显著相关。四区化合物聚为两类,样品A呈现醇类显著相关,样品E呈现醇类、苯酚显著相关,样品B、C、D呈现负相关。

图5 5个部位化合物聚类分析热图

样品A显著相关于化合物甲基-3-丁烯-1-醇、邻二甲苯、1-戊醇、丁基化羟基甲苯、苯甲醇、2-乙基-1-己醇、2-乙基苯乙酯、1-壬醇、二乙二醇单乙醚;样品B显著相关于化合物乙醛、庚醛、间异丙基甲苯;样品C显著相关于化合物苯甲醛、间二甲苯、乙基苯、对二甲苯、苯甲酸;样品D显著相关于化合物壬醛、辛醛、1-甲氧基-4-甲基苯、庚醛、1-辛醇、癸酸、4-苯基-2-丁酮、2(5H)-呋喃酮;样品E显著相关于化合物糠醛、苯乙醛、苯乙酮、3-噻吩甲醛、肉桂醛、十六醛、己酸、2-呋喃甲醇、甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2-乙酰吡咯、2,4,5-三甲基噻唑、3-己酮、二甲基三硫化物、二甲基二硫化物、丁酸、萘、苯酚、烯丙基甲基硫醚、2,4-二叔丁基苯酚、2-乙酰基噻唑。

结果表明,样品B、D化合物成分相似,样品A、C化合物有一定差异性和相似性,样品E化合物成分显著差异于其他样品。

2.4 数据融合分析

2.4.1 主要化合物判别分析

选择每个种类中前5种相对含量较高的化合物进行热图分析[36],可以分辨出主要化合物。

由图6可知,苯甲醛、间二甲苯、壬醛、邻二甲苯、2-乙基-1-己醇、对二甲苯、苯甲醇、辛醛、1-辛醇、1-辛稀-3-醇、乙基苯、庚醛、己醛、己酸、2-乙酰基吡咯是青海玉树牦牛肉的主要化合物。其中,样品A中苯甲醛含量较高,是样品A的主要化合物;样品B中苯甲醛、壬醛含量较高,是样品B的主要化合物;样品C中苯甲醛、间二甲苯、壬醛含量较高,是样品C的主要化合物;样品D中苯甲醛、间二甲苯、辛醛、2-乙基-1-己醇含量较高,是样品D的主要化合物;样品E中苯甲醛、壬醛含量较高,是样品D的主要化合物。分析结果表明,牦牛肉不同部位主要化合物存在相似性和差异性。

图6 牦牛肉主要化合物热图

2.4.2 相关性分析

数据融合分析是将多个传感器采集的局部、不完整信息或数据加以融合,分析出更正确、可靠的结论[37-38]。采用Pearson线性相关系数分析,将电子鼻传感器数据与牦牛肉共有化合物进行相关性分析。R代表X轴、Y轴的线性相关程度,绝对值R越大,相关性越强,绝对值R越小,相关性越弱(R值在1～-1之间),其结果见图7。

图7 电子鼻数据与主要牦牛肉化合物皮尔斯相关性分析图

2-乙基-1-己醇、苯甲醇、丁基化羟基甲苯、二乙二醇单乙醚均与P型、T型的全部12根传感器呈显著正相关,这两类传感器对有机化合物、可燃烧气体敏感、芳香族化合物、极性化合物敏感,如醇、醚、甲烷、甲苯、二甲苯、乙醇、碳氧基;2-乙酰基噻唑、2,4-二叔丁基苯酚与传感器P30/2、T40/1、T40/2、TA/2呈正相关,这类传感器对有机化合物、硫化氢敏感,如硫化物、硫醚;1-庚醇、1-己醇、2-乙酰基噻唑、2,4-二叔丁基苯酚与传感器LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCT1呈显著负相关,这类传感器对有毒气体、有机化合物、碳氧基化合物敏感[39],如醇、酮、氨、硫化氢;明显可见化合物与传感器存在相关性,由相关性分析结果确认电子鼻也能区分化合物成分。

3 结论

模糊综合评分结果为A>E>C>B=D,样品A、E、C模糊数学评定优于样品B、D;电子鼻结果:传感器信号强度差异明显,样品A在传感器T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2上完全独立于其他样品;青海牦牛肉共鉴定出60种化合物,醛类含量34.86%～53.65%、醇类含量8.91%～23.66%、烃类含量8.39%～35.98%、酸类含量2.64%～8.52%、酮类含量0.36%～2.04%、杂类含硫、醚化合物含量3.47%～17.92%,确定牦牛肉不同部位化合物差异较大,其中,醛类是青海牦牛肉的主要化合物,醇类起关键贡献;苯甲醛、间二甲苯、壬醛、邻二甲苯、2-乙基-1-己醇、对二甲苯、苯甲醇、辛醛、1-辛醇、1-辛稀-3-醇、乙基苯、庚醛、己醛、己酸、2-乙酰基吡咯是青海牦牛肉的主要化合物;不同部位化合物存在相似性和差异性,由相关性分析结果确认电子鼻也能区分化合物成分。

研究结果具有一定的切实性,可以为今后牦牛肉风味特征辨别提供理论依据和数据参考。