基于HS-SPME-GC-MS对禄丰香醋挥发性风味物质及成分分析

赵锐环,陈乾睿,安梅,李桂兰,康小艳,徐志强 *

(1.云南农业大学 食品科学技术学院,昆明 650201;2.云南农业大学云南省畜产品加工工程技术研究中心,昆明 650201)

食醋大多是以谷物或水果为基本原料,经微生物相互作用发酵而成的一种液态产品[1],通常被用作酸味调味,其口感丰富、风味独特。

我国传统食醋独具风味、种类繁多、各具特色,其中山西老陈醋、四川阆中保宁醋、福建永春老醋和江苏镇江香醋被誉为我国的“四大名醋”,发酵方式为固态发酵的酸醋种类有山西老陈醋、四川阆中保宁醋、江苏镇江香醋,福建永春老醋为液态静置发酵。禄丰香醋又称发酵米醋,是原产于云南省楚雄市禄丰市的一种发酵米醋,原料使用了糯米,通过酒曲的糖化,黑曲、酵母、米曲、红曲的后糖化、酒化、醋化发酵等工序制成[2]。微生物在发酵过程中的来源多种多样,来源于麸皮、谷壳以及周围的环境,而且通过微生物自身的生存进化以及环境的适应,使发酵过程中的微生物种类处于动态平衡的同时,不断使淀粉发生糖化、酒化、醋化,形成颇有禄丰特色的地方发酵产品。由于对禄丰香醋的研究大部分集中在其传统工艺的优化和改进方面,而对其风味成分的研究鲜有报道。

当前,对挥发性成分分析的方法多种多样,各有优缺点。其中液液萃取(LLE)分离效果最好,但消耗试剂量多[3];固相萃取(SPE)试剂用量少,但操作步骤多,且回收率较低[4];固相微萃取(SPME)不用有机溶剂,但萃取材料的量少[5];顶空固相微萃取(HS-SPME)操作步骤简单、重现性好,但运用的范围窄[6];搅拌棒吸附萃取(SBSE)回收率高、重复性好,但设备价格昂贵[7]。因此对食醋中挥发性风味物质的研究大多采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS),集采样、萃取、进样于一体,加快了分析检测速率。李攀恒等[8]采用HS-SPME结合GC-MS测定山西老陈醋中的挥发性香气物质,共检测出80种,分别为酯类、醇类、酸类、醛类、酮类、吡嗪类和其他类;郑战伟等[9]采用HS-SPME-GC-MS对山西老陈醋、江苏镇江香醋、四川阆中保宁醋和福建永春老醋4种具有代表性的食醋香气成分进行分析,得到多种香气化合物。其中检测得到的香气化合物种类较多的是山西老陈醋,对应的酯类和杂环类化合物的种类和数量也最多。研究表明固态发酵醋的香气成分种类数远远高于液态发酵醋,这与姚金霞等的研究结果相似[10-11],同时发现食醋的香气化合物与发酵年份有关,年份越久,香气化合物的种类越多。

在此基础上,本研究探究了不同年份禄丰香醋的理化品质,利用HS-SPME-GC-MS检测技术对禄丰香醋的挥发性风味物质进行检测,并利用正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)和变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)解析不同年份禄丰香醋样品中的主要风味物质,为提升禄丰香醋的风味品质提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同年份禄丰香醋样品:均来自禄丰香醋厂;葡萄糖、硫酸铜、氯化钠、无水乙醇、氢氧化钠、亚铁氰化钾、酒石酸钾钠、磷酸、盐酸(均为分析纯):购于上海源叶生物科技有限公司;2-辛醇(色谱纯):购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B-5977B GC-MS联用仪、 DB-Wax色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm) 美国 Agilent 公司;HH-4数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司;HANNA HI9025 pH计 北京亿赛得科技发展有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 理化指标的测定

还原糖含量:参照GB 5009.7—2016测定;氨基酸态氮含量:参照GB 5009.235—2016以及杜善良等[12]的方法测定;pH值:采用pH计测定。

1.3.2 SPME-GC-MS 检测方法

SPME条件:取醋样100 μL于20 mL 顶空瓶中,再加入10 μL 2-辛醇并密封。水浴(60 ℃、15 min),将萃取头插入顶空瓶中(60 ℃、30 min),取出后插入GC 进样口,20 ℃下解吸 4 min,进行GC-MS 分析。

GC条件:色谱柱采用 DB-Wax(30 m×250 μm×0.25 μm),进样口温度250 ℃,不分流进样,载气为氦气,恒流模式;柱流速1 mL/min;程序升温(40 ℃、4 min),以 5 ℃/min升到245 ℃,保持5 min。

MS条件:电子电离源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;质量扫描范围(m/z)20～400 Da。

使用LECO Chroma TOF V4.3X软件,和NIST数据库对质谱数据进行分析。

1.3.3 醋样香气成分半定量分析

采用内标法对风味物质进行半定量分析,以2-辛醇为内标物。

1.4 数据分析

采用Origin 8.5和Excel对实验数据进行处理、分析以及图形绘制;采用SPSS 20.0进行差异显著性分析,P<0.05表示差异显著;采用SIMCA-P进行OPLS-DA和VIP值分析。

2 结果与分析

2.1 禄丰香醋理化指标分析

4个不同年份禄丰香醋的理化指标见表1。

表1 禄丰香醋理化指标分析结果

总酸在一定程度上能够反映酸醋的质量[13],禄丰香醋的pH为4.60～4.70,总酸为0.51～0.54 g/100 g,且两者之前存在一定的相关性,总酸与pH呈负相关,这与张林祥等的研究结果一致,禄丰香醋的pH高于镇江香醋的pH(3.60～3.90)[14],低于赤水晒醋的pH(5.75～6.20)[15],这可能与发酵的原料、发酵时所选用的微生物、发酵场地和储存时间的差异有关。

还原糖在发酵过程中为微生物提供能量,发酵前期大量利用还原糖,随着发酵速度的减缓,还原糖在后期含量保持稳定[16],同时还原糖还能调节发酵醋柔和的口感[17]。禄丰香醋的还原糖含量为1.2～1.4 g/100 g,与Wu等[18]测定镇江香醋的研究结果类似,还原糖含量也是1.2～1.4 g/100 g。发酵醋中的氨基酸态氮是指以氨基酸形式存在的氮元素,发酵醋的品质受到该含量的影响,含量越高,表明发酵醋的鲜味越浓郁[19]。4个醋样中的氨基酸态氮含量为0.39～0.42 g/100 g,山西老陈醋的氨基酸态氮含量为0.21 g/100 g[20],镇江香醋的氨基酸态氮含量为0.28～0.30 g/100 g。禄丰香醋的氨基酸态氮与镇江香醋的类似,可能与它们所使用的原料都是糯米有关,山西老陈醋的原料是大麦和豌豆[21]。

2.2 禄丰香醋香气成分分析

为评价4个不同年份禄丰香醋的香气成分差异,采用 HS-SPME-GC-MS 分析鉴定禄丰香醋挥发性化合物成分以及含量,结果见图1和图2。

图1 不同年份挥发性物质种类和含量

图2 不同年份总挥发性物质含量

不同年份禄丰香醋挥发性成分分析结果见表2。

表2 不同年份禄丰香醋挥发性成分分析结果

在一定程度上,样品的风味特征取决于挥发性化合物的组成和含量[22]。4个不同年份的样品中共检测到120种化合物,包括9种醇类物质、21种醛类物质、7种酸类物质、24种酯类物质、17种酮类物质、7种酚类物质、11种烷烃类物质、3种烯烃类物质以及21种杂环类物质。4个不同年份禄丰香醋中挥发性成分各组分含量占比在一定程度上存在差异,其中酸类、酯类、醇类、酮类以及杂环类在不同年份禄丰香醋的所有挥发性化合物中占比较高。2017年的禄丰香醋挥发性化合物含量最高,为(86.65±8.33) μg/L,2018年、2019年、2020年的禄丰香醋挥发性化合物含量分别为(76.35±5.95),(68.71±7.51),(64.75±11.96) μg/L,表明挥发性化合物的种类、含量与年份有关,这与杜大钊等[23]采用SPME-GC-MS技术解析四川麸醋及其陈酿过程中挥发性成分的研究结果类似。

酸类的产生与醋酸发酵阶段有关,原料中的碳水化合物在酶和微生物的作用下转化为酸,一部分氨基酸降解也会产生酸[24]。同时酸类也是食醋重要的组成部分,占禄丰香醋香气成分的26%～41%,赋予禄丰香醋特定的风味及感官属性。其中含量最多的是乙酸、异戊酸,这与孙宗保等[25]采用基于GC-O-GC联用技术分析4个醋龄镇江香醋挥发性成分的研究结果一致,表明乙酸是食醋中的主要风味物质。其中在2020年的禄丰香醋中异戊酸的含量为(8.19±0.58) μg/L,其余年份的含量都在9 μg/L以上,这与简东振等[26]的研究结果类似,表明异戊酸的产生会受到陈酿时间的影响。

醛类物质是在酒精发酵阶段或陈酿阶段由醇或酸的缩合反应产生的[27],占禄丰香醋香气成分的6%～9%,其中异戊醛、苯乙醛、糠醛的含量较多。在陈酿过程中,糠醛、异戊醛的产生与氨基酸脱氨、脱羧有关,其含量与陈酿时间相关,苯乙醛的形成与氨基酸的代谢密切相关[28]。

醇类物质是酵母作用下氨基酸的代谢物[29],占禄丰香醋香气成分的11%～16%,其中乙醇、苯乙醇、2-甲基丁醇、2,3-丁二醇的含量较多,由大多数微生物分解糖苷类、氨基酸和脂肪酸产生,大多发生在酒精发酵阶段[30]。禄丰香醋中的主要醇类物质与张奶英[31]采用SPME-GC-MS技术分析四川麸醋发酵及陈酿过程中挥发性物质的动态变化的研究结果一致,2,3-丁二醇能增加禄丰香醋的香味,由于醇类物质是在微生物的作用下产生的,醇类物质的生成与酿造、陈酿过程中微生物的丰富度有关。

酯类物质的生成主要在酒精发酵、醋酸发酵以及陈酿阶段,由醇与相应的酸或辅酶缩合而成,其中酯的含量受水分含量和酯类前体物质浓度的影响[32],占禄丰香醋香气成分的12%～21%,其中乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、2-羟基-4-甲基戊酸乙酯、丙位壬内酯含量较多。酯类物质会产生令人愉悦的水果香味[33],对醋的香气成分起到重要的影响作用。

酮类物质是一种发酵副产物,在酒精和醋酸发酵过程中产生[34—35],占禄丰香醋香气成分的3%～12%,其中2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、2-丁酮、2-呋喃酮、2-甲基-3辛酮含量较多,它们对醋的香味成分有着重要的贡献,2,3-丁二酮也是山西陈醋中的关键风味物质,是关键风味化合物吡嗪的前体[36—37]。

杂环类及酚类物质在禄丰香醋中的含量较少,形成过程较复杂,大部分来自酿造的原料,其中六甲基环三硅氧烷的含量较高,可能会与其他物质杂糅,赋予禄丰香醋独特的风味,这与王栋等[38]采用HS-SPME-GC技术对镇江恒顺香醋香气成分进行分析的结果类似。

2.3 不同年份禄丰香醋挥发性成分PCA及OPLS-DA分析

建立OPLS-DA对不同年份的禄丰香醋进行分析比较,OPLS-DA模型中R2X和R2Y表示所建模型对X和Y矩阵的解释率,Q2表示模型的预测能力,R2和Q2反映模型的好坏。由图3可知,4组样品之间有明显的分开趋势,其中2017年、2018年聚为一类,表明这2组样品中挥发性风味化合物对禄丰香醋整体香气贡献相似,而2019年、2020年分开聚类,表明这2组样品的风味化合物对香气总体贡献不同于其他2组,可能与风味物质含量较多有关。由图4可知,累计R2X(cum)=0.7,R2Y(cum) =1,Q2(cum)=0.982,累计R2X(cum)=0.706,R2Y(cum)=1,Q2(cum)=0.975,累计R2X(cum)=0.72,R2Y(cum)=0.999,Q2(cum)=0.976,表明不同年份的禄丰香醋OPLS-DA模型具有良好的稳定性和较好的预测能力。

图3 不同年份禄丰香醋挥发性成分PCA图

图4 不同年份禄丰香醋挥发性成分OPLS-DA图

2.4 不同年份禄丰香醋挥发性成分VIP 分析

由图5可知,变量投影重要性(VIP)可以量化OPLS-DA的每个变量对各组样本分类的判别,当VIP>1时,表明对组间分离具有重要贡献,其值越大,变量在不同年份禄丰香醋组间的差异性越明显。通过分析,共筛选出12种代谢物作为潜在的挥发性特征标志物,包括酮类2种、酯类4种、醇类1种、酸类3种、醛类2种,与史玉等[39]的研究结果类似。其中,酯类物质的种类较多,酯类物质一般具有令人愉悦的水果香味,对原醋最终的风味有着极显著的影响[40]。其次是酸类物质,它与其他成分相互作用、相互调节,共同构成禄丰香醋独特的风味[41]。

3 结论

本研究分析和比较了不同年份禄丰香醋的理化特性和挥发性风味物质。结果表明,不同年份禄丰香醋的还原糖含量和总酸含量无显著性差异,pH、氨基酸态氮含量存在差异。4个不同年份的样品中共检测到120种化合物,包括9种醇类物质、21种醛类物质、7种酸类物质、24种酯类物质、17种酮类物质、7种酚类物质、11种烷烃类物质、3种烯烃类物质以及21种杂环类物质,各组分含量占比存在差异,但组分含量最多的包括乙酸、异戊酸、异戊醛、苯乙醛、糠醛、乙醇、苯乙醇、2-甲基丁醇、2,3-丁二醇、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、2-羟基-4-甲基戊酸乙酯、丙位壬内酯、2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、2-丁酮、2-呋喃酮以及2-甲基-3辛酮。PLS-DA结合VIP值判断乙醇、2,3-丁二酮、异戊酸、苯乙醛、乙酸乙酯、乙酸异戊酯是造成不同年份禄丰香醋风味差异的物质。