六味酸枣汤治疗围绝经期失眠的作用机制：基于网络药理学与动物实验

张 倩，张梅奎，刘颖璐，王 妍，吕菲菲，王毓国

1解放军总医院第六医学中心中医学部，北京 100048；解放军总医院2医疗保障中心远程医学科，3第一医学中心神经内科学部，北京1008531

我国每年有近一千万的女性进入围绝经期，随着老龄化社会的加速，到2030年这一数字很可能超越2.1亿，而围绝经期失眠（PI）人群将会出现历史新高［1］。研究表明，75%～81%的围绝经期女性会出现失眠，是其他时期的2.4倍［2］。如得不到及时有效地治疗，极易导致焦虑、抑郁等心理障碍［3］。同时，失眠还增加了肥胖、糖尿病、中风和冠心病等并发症的风险［4］。现代研究认为，PI主要与卵巢机能衰退导致雌激素降低，导致下丘脑-垂体-卵巢轴功能紊乱有关［5］。目前临床治疗方式包括激素替代法、镇静催眠药、认知行为法等，但效果不稳定，还会引起子宫出血、肿瘤和血栓等不良反应，因此，亟需副作用小、疗效好的新方法［6-8］。由六味药食同源中药组成的六味酸枣汤（LWSZD）是解放军总医院张梅奎教授运用辨证论治思想在实践中摸索总结的临床经验方，几十年临证取得良好效果，深受患者喜爱，但作用机制尚不明确。

因此，我们借助网络药理学方法揭示其主要活性成分、关键治疗靶点和作用途径等内在机制，并运用分子对接技术和动物实验验证，为临床应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级雌性SD大鼠48只（200±20 g），购于成都达硕生物科技有限公司，质量合格证号：NO.0043165，许可证号：[SCXK（川）2020-030]，经陕西中医药大学伦理委员会批准（批准号：SUCMDL20200522003），饲养于陕西中医药大学创新协同中心实验室，控制22 ℃～25 ℃，相对湿度60%～65%，噪声65分贝以下，光、暗各12 h。

1.1.2 药物 六味酸枣汤由炒酸枣仁、牡蛎、莲子、百合、灵芝、茯苓组成，以上中草药饮片均由采购于陕西中医药大学附属医院中药房，经鉴定、浸泡、煎煮、浓缩后，按成人临床等效剂量的1、2、4 倍，分别配置为1.9、3.8、7.6 g/kg的药液，4 ℃避光密封保存。

1.1.3 试剂与仪器 对氯苯丙氨酸（大连美仑生物技术有限公司，批号：MB373），酒石酸唑吡坦片（赛诺菲公司，批号：H20181237），戊巴比妥钠（湖北鸿运隆生物科技有限公司，批号：3643E023），青霉素V钾片（哈药集团制药总厂）。Elisa 试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司，RNA 提取试剂盒（Servicebio）。酶标仪（PerkinElmer，型号VICTORX5）、荧光定量PCR 仪（ABI，型号：Stephone plus）。

1.2 方法

1.2.1 六味酸枣汤活性成分和潜在靶点的获取与网络构建 采用中药系统药理学分析平台(TCMSP,https://tcmspw.com/tcms-p.php) 和 Batman-TCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/），分别以“口服利用度OB≥30%和类药性DL≥0.18”与“Score cutoff≥20，Pvalue cutoff<0.05”为筛选条件，获取六味酸枣汤的主要活性成分和潜在靶点［9］。使用Cytoscape 3.7.2对脑疏宁的中药组成、活性成分和作用靶点进行梳理，构建可视化网络。

1.2.2 围绝经期失眠相关靶点预测 以“Perimenopausal Insomnia”作为关键词，应用在线《人类孟德尔遗传》数据库（OMIM,https://www.omim.org/）、人类基因数据库（Genecards,https://www.genecards.org/）和Gene 数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/），限定物种为"Homo Sapiens"，查找去重后得到PI相关基因靶点［10］。运用Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据库对疾病和药物靶点进行校正，两者取交集获得共同靶点，用Venny 2.1绘制“药物-疾病”靶点的韦恩图。

1.2.3 蛋白-蛋白互作网络构建与分析 将共同靶点导入STRING（https://string-db.org/）数据库，选择物种为“Homo sapiens”，最低置信度设为0.4，对交集靶点进行相互作用关系分析并构建PPI网络［11］。导入Cytoscape 3.7.2软件，利用Network Analyzer功能计算节点度值，取前十位的靶点作为核心靶点。

1.2.4 GO富集及KEGG通路分析 采用DAVID数据库对共同靶点进行基因本体（GO）功能分析，包括生物学过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组成（CC），并进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。以P<0.05为标准筛选显著富集的GO条目和KEGG通路，以条形图和气泡图进行展示［12］。

1.2.5 “药物-活性成分-靶点-通路-疾病”网络图构建 根据KEGG通路分析结果，综合整理中药、活性成分、基因靶点、疾病、通路等数据之间的相互关系，利用CytoScape 3.7.2软件构建“药物-活性成分-靶点-通路-疾病”网络并进行可视化。

1.2.6 分子对接验证 将Degree前3位的ESR1、SIRT1和SERPINE1与六味酸枣汤主要活性成分以及临床治疗PI 常用药酒石酸唑吡坦进行分子对接实验。在PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载主要活性成分的三维结构，结合PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）蛋白结构，采用AutoDock Vina软件进行分子对接，比较药物之间的结合能差异，并利用Pymol展示部分结果。

1.2.7 动物实验验证 取48只大鼠随机分为假手术组（8只，Sham）和造模组（40只），采用双侧卵巢切除术和对氯苯丙氨酸腹腔注射建立PI模型，以阴道脱落细胞涂片和翻正反射实验判断模型成功与否［13,14］。随后将造模组随机分为模型组（Model）、阳性对照组（Zopiclone）和中药低（Low）、中（Medium）、高剂量组（High），分别予以生理盐水10 mL/kg、唑吡坦10 mg/kg以及六味酸枣汤9.0、18.0、36.0 g/kg灌胃，连续8 d。

1.2.8 大鼠睡眠情况检测 末次灌胃8 h后称取大鼠的体质量，以戊巴比妥钠28 mg/kg进行腹腔注射进行戊巴比妥钠协同的翻正反射实验，比较各组大鼠睡眠潜伏期和睡眠时长。

1.2.9 激素及核心靶点的蛋白及mRNA表达水平 于各组大鼠腹主动脉处取血，离心取上清，采用ELISA法测定血清雌激素、卵泡刺激素、黄体生成素等激素水平。无菌条件下剥离下丘脑组织，经提取蛋白、凝胶电泳、一抗二抗处理后，采用Adobe Photoshop分析各组ESR1和SIRT1蛋白表达情况。采用Trizol法提取下丘脑组织总RNA，反转录合成cDNA，进行PCR扩增反应，检测ESR1 mRNA和SIRT1 mRNA表达水平。反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，最后72 ℃延伸10 min，共循环30次，然后对PCR 产物行琼脂糖凝胶电泳。引物信息为：ESR1: F-AAGACGCTCTTGAACCAGCA；R-TCTC CAGGTAGTAGGGCACC；SIRT1：F-CGGCTACCGA GGTCCATATAC；R-CTGCAACCTGCTCCAAGGTA；β-actin：F-GAGCCACCAATCCACACAGA；R-AGAC CTCTATGCCAACACAGT。

1.2.10 统计学分析 采用SPSS 22.0软件分析数据，计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 六味酸枣汤主要活性成分及潜在靶点

通过TCMSP和Batman-TCM数据库检索，并补充已发表的相关文献资料，筛选后获得六味酸枣汤6味中药中包含99个有效活性成分，按照所有活性成分的OB数值排序，前10位的活性成分（表1）。筛选得到潜在靶点389个，各中药、活性成分与潜在靶点的相互作用关系（图1），含有494个点和952条边。

图1 “中药-主要活性成分-靶点”网络图Fig.1 "Herb-compound-target"network of LWSZD.

表1 六味酸枣汤主要活性成分信息Tab.1 Top 10 active compounds in LWSZD according to the OB value

2.2 PI相关靶点及六味酸枣汤治疗靶点

利用OMIM、Genecards 和Gene 数据库，以“Perimenopausal Insomnia”为关键词进行搜索，合并并去重后获得基因靶点187个。与六味酸枣汤潜在靶点取交集操作获得15个治疗靶点，并绘制韦恩图（图2）。

图2 药物-疾病共同靶点韦恩图Fig.2 Venn diagram of the LWSZD-and PI-related targets.

2.3 PPI网络构建与分析

将六味酸枣汤与PI的共同靶点上传至STRING数据库，得到PPI网络图包含14个节点，36条边。节点大小和颜色均与Degree值呈正相关，Degree越大，节点越大，颜色越深，其相关度越大，节点间连线表示靶点间存在潜在的相互作用关系（图3）。Degree较高的核心靶点为雌激素受体1（ESR1/ERα）、沉默调节蛋白1（SIRT1）、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1（SERPINE1）、儿茶酚氧位甲基转移酶（COMT）和趋化因子CC配体2（CCL2）等，具体参数信息（表2）。

图3 六味酸枣汤治疗PI的核心靶点PPI网络图Fig.3 PPI network of Core targets of LWSZD for PI.

表2 六味酸枣汤治疗PI的核心靶点信息Tab.2 CCore targets of LWSZD in the treatment of PI

2.4 GO功能及KEGG通路富集分析

运用DAVID 数据库“Functional Annotation Tool”功能分析共同靶点的内在关联，发现BP相关条目53个，CC相关条目4个，MF相关条目17个，以P<0.05进一步筛选表明六味酸枣汤治疗PI的主要生物学过程集中在RNA聚合酶II启动子对转录的正向调节、对药物的反应和转录的正向调节等；细胞成分主要为常染色质、丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物和染色质；分子功能主要为蛋白结合、酶的结合与相同的蛋白质结合等（图4）。KEGG通路分析表明多巴胺能突触途径和酪氨酸、色氨酸代谢等为主要作用途径（图5）。

图4 GO 功能富集分析图Fig.4 GO enrichment analysis.

图5 KEGG 通路富集分析气泡图Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis.

2.5 “药物-活性成分-靶点-通路-疾病”网络图构建

选取前10位KEGG通路分析结果，通过整合通路、治疗靶点、中药、活性成分与疾病之间的映射关系，利用Cytoscape3.7.2软件构建“药物-活性成分-靶点-通路-疾病”网络图，结果共获得100个节点和236条边。其中，橙色长方形节点为六味酸枣汤，绿色菱形为中药组成，蓝色椭圆形为活性成分，黄色六边形为共同靶点，紫色倒三角形为作用途径，红色长方形为PI，相互作用关系可视化（图6）。

图6 “药物-活性成分-靶点-通路-疾病”网络图Fig.6 Herb-component-target-pathway network.

2.6 分子对接验证

利用AutoDockTools软件对核心治疗靶点与六味酸枣汤主要活性成分和对照药酒石酸唑吡坦进行分子对接，比较结合能差异。结果显示主要活性成分Armepavine、Sanjoinenine和Mairin与核心靶点ESR1、SIRT1和SERPINE1的结合能均小于-5.0 kcal/mol-1，且优于阳性药或两者相当，如ESR1 与Zopiclone、Armepavine结合能分别为-6.4和-8.1，具体结果见表3，部分可视化结果见图7。

图7 核心靶点与主要药物的分子对接图Fig.7 Schematic diagram of molecular docking of interaction between core active components and targets.

2.7 六味酸枣汤对PI大鼠睡眠、激素水平与主要靶点的调节作用

结果表明，模型组较假手术组睡眠潜伏期明显延长、睡眠时间缩短，雌激素E2水平和ESR1与SIRT1的蛋白和mRNA的表达量降低，同时，卵泡刺激素、黄体生成素和下丘脑促性腺激素释放激素水平升高（P<0.01或P<0.05）。阳性对照组较模型组大鼠睡眠间期缩短且睡眠时间延长（P<0.01），但在激素水平与ESR1 和SIRT1的蛋白与mRNA表达方面，两者比较均无统计学差异（P>0.05）。而中药高剂量组大鼠睡眠间期较模型组减少且睡眠时间延长（P<0.01），E2水平高于模型组（P<0.01），LH、FSH和GnRH水平均低于模型组（P<0.01或P<0.05），同时，下丘脑组织ESR1与SIRT1的蛋白与mRNA表达水平均高于模型组（P<0.01，图8～11）。

图8 各组大鼠睡眠潜伏期及睡眠时间Fig.8 Sleep latency and sleep time of rats in each group.bP<0.01 vs the sham group;cP<0.05,dP<0.01 vs the model group.

图9 各组大鼠HPO轴相关激素浓度Fig.9 Concentration of HPO axis-related hormones in each group of rats.bP<0.01 vs the sham group;cP<0.05,dP<0.01 vs the model group.

图10 各组大鼠下丘脑组织ESR1和SIRT1蛋白表达水平Fig.10 The protein expression levels of ESR1 and SIRT1 in ovarian tissues of rats in each group.bP<0.01 vs the sham group;cP<0.05,dP<0.01 vs the model group.

图11 各组大鼠下丘脑组织ESR1mRNA和SIRT1mRNA表达水平Fig.11 Expression levels of ESR1 mRNA and SIRT1 mRNA in ovarian tissues of rats in each group.bP<0.01 vs the sham group;cP<0.05,dP<0.01 vs the model group.

3 讨论

围绝经期女性承受着工作、家庭和生活等多重压力，失眠是最常见和最危险的临床症状，PI是免疫、内分泌、神经、心血管等疾病和心理障碍发生发展的重要诱因，关注和维系此时女性的健康至关重要［15,16］。虽然现代医学疗法起效快，但存在严重不良反应。如，长期使用激素会增加乳腺癌和子宫内膜癌风险［17］。镇静药可明显损害肝肾功能［18］。因此，迫切需要更安全、更高效的治疗药物。临床实践发现，中药复方等非药物疗法在PI方面取得较好效果，且副作用少［19,20］。本病属中医“绝经前后诸证”范畴，病机责之肾精亏虚、阳不入阴。六味酸枣汤由六味食材药物组成，以酸枣仁、牡蛎为君，共入心、肝、肾经，可镇静安神、疏肝养肾；以百合养阴，莲子补脾养肾，共为臣药；灵芝助百合滋阴养心；茯苓，主利水渗湿、安神，可防止百合滋阴太过，灼伤脾土，还可助莲子健脾，使后天气血津液生化有度，髓海充盈，肝体柔软，神魂皆有处可归，与灵芝共为佐使。诸药合奏安神、疏肝、补肾、调血、理气之功，药食同源中药组成是本方的一大特色，临床取得良好效果，深受患者喜爱，故本文应用网络药理学和分子对接技术阐明其作用机制。本文首先借助TCMSP和Batman-TCM数据库对六味酸枣汤的活性成分和作用靶点进行检索，获得主要活性成分99个，药物靶点389个，主要活性成分为亚美异粟碱、酸枣仁环肽和白桦脂酸。文献研究也表明此三者均具有促眠效果，如莲子中的主要成分亚美异粟碱可有效作用于心肌细胞和脑动脉，通过扩张和保护心脑血管，产生安神助眠效果［21］；酸枣仁环肽为酸枣仁核心成分；刘鑫等［22］发现其能够上调老年慢性快动眼睡眠剥夺模型大鼠SIRT3和SOD2水平，改善氧化应激水平，减轻线粒体损伤，促进睡眠，同时还具有抗焦虑和抗惊厥作用；酸枣仁的主要活性成分白桦脂酸可降低小鼠脑皮质和海马MDA含量，增加SOD和GPX活性，缓解氧化应激状态，进而产生助眠和抗炎作用［23］。结合本研究结果与既往文献结论，可见亚美异粟碱、酸枣仁环肽和白桦脂酸对PI具有治疗作用和研究潜力。

应用OMIM、Genecards 和Gene 数据库筛选出PI相关靶点187个，中药潜在治疗靶点15个，经过PPI分析获得的核心靶点为ESR1、SIRT1、SERPINE1、COMT和CCL2等。已有研究证实，ESR1、SIRT1、SERPINE1与PI关系密切。研究表明，雌激素受体ESR1广泛存在于皮肤、主动脉、中枢神经等组织器官，围绝经期ESR1降低引发代谢紊乱，尤其是分布在睡眠-觉醒相关大脑核团中的雌二醇及ESR1变化，能够影响多巴胺水平，干扰神经递质传导，引起失眠［27］。同时，雌激素与血管壁ESR1结合，干扰血管收缩舒张功能，引发下丘脑体温调节中枢紊乱，出现潮热、出汗、心悸，也能影响情绪和睡眠［28］。在切除卵巢后，快相睡眠和非快眼动睡眠增加，精神行为异常，经过雌激素治疗后失眠缓解［29］。其次，产生雌激素的下丘脑-垂体-卵巢及相关激素组成的HPO轴是关键调节因素。围绝经期女性卵巢功能紊乱，雌激素减少，HPO轴负反馈调节被打乱，卵泡刺激素和黄体生成素反馈性增加，导致失眠。此外，雌激素减少引起氧化应激水平的异常升高，致使睡眠调节蛋白失活和星形胶质细胞ATP分泌异常，引起昼夜节律紊乱，而SIRT1可以通过去乙酰化昼夜节律相关蛋白，抗氧化损伤，从而调节失眠节律［30,31］。再者，SERPINE1是丝氨酸多肽酶抑制物E1，负责编码纤溶酶原激活物抑制剂1，后者的调节脑电生理和抗纤溶蛋白能力，与失眠、阿尔茨海默病、子痫等疾病密切相关［32］。综上，本研究与文献研究均证实，ESR1、SIRT1和SERPINE1是PI发病的核心因子，而三者同时是六味酸枣汤的作用靶点，揭示了其发挥治疗作用的关键环节，对药物研发和深入机制研究具有指导和借鉴价值。

GO与KEGG通路分析显示，六味酸枣汤对PI的调节作用集中在RNA聚合酶II启动子对转录的正向调节和转录的正向调节等生物学过程，与多巴胺能突触途径和酪氨酸、色氨酸代谢等有关。有研究证实，氨基酸代谢和多巴胺与5-羟色胺等神经递质的合成与传导密切相关，后者直接调节“睡眠-觉醒”节律［33］。“药物-活性成分-靶点-通路-疾病”网络图的构建显示六味酸枣汤具有多成分、多靶点、多途径的特点和优势。分子对接表明，主要活性成分与核心靶点ESR1、SIRT1和SERPINE1有较好的结合力，特别是部分活性成分的结合性能优于酒石酸唑吡坦，显示出中药复方的多靶点优势，是本实验的主要发现之一。为进一步证实中药治疗PI的效果，验证网络药理学与分子对接结论，我们运用酒石酸唑吡坦和不同浓度的中药干预PI大鼠，检测结合能力突出的ESR1和SIRT1检测蛋白与基因表达水平。结果表明六味酸枣汤能有效改善PI模型大鼠睡眠潜伏期和睡眠时长，调节雌激素及HPO轴相关激素水平，恢复激素反馈状态，促进下丘脑组织ESR1和SIRT1的蛋白与基因表达，以高剂量中药效果最为显著，而阳性对照药酒石酸唑吡坦虽然能够有效调节大鼠睡眠，但在激素水平和核心靶点的蛋白与mRNA调节方面并无明显效果。

综上所述，本研究应用网络药理学方法揭示了六味酸枣汤治疗PI的主要活性成分、核心基因靶点和关键通路，结合分子对接方法对主要成分与核心靶点进行验证，同时借助动物实验进一步阐明了中药复方的疗效和机制，为临床应用提供了理论和实验基础，为PI的治疗实践提供新的思路。