NO 对不同盐碱胁迫下藜麦幼苗生长及氮代谢的影响

冯 垚，赵 颖,2，魏小红,2

（1.甘肃农业大学生命科学技术学院, 甘肃 兰州 730070；2.省部共建干旱生境作物重点实验室 甘肃农业大学, 甘肃 兰州 730070）

土地盐碱化是限制农业生产的重要环境因素之一，植物在长期适应盐碱过程中进化出一系列的生理变化来与之响应。藜麦(Chenopodium quinoa)属于藜科藜属一年生四倍体双子叶草本植物，起源于南美洲安第斯山脉[1]。其大多数品种有较强的耐盐、耐瘠薄特性和极高的营养价值，且可以适应高海拔的环境，故继青稞(Hordeum vulgare)后成为我国西北地区广泛种植的经济作物。但由于西北地区分布着大量的盐碱地，加之温室效应、灌溉不合理等原因，导致土壤盐碱化问题愈发严重[2]，因此，提高藜麦对盐碱的耐受性已成为保障藜麦高产稳产的重要途径。

氮素是植物重要的营养元素，是植物生长发育的核心元素之一，是调控植物生长发育的关键因素。多数植物能以硝酸盐作为氮源，需要通过硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)把从外界吸收的氧化态NO3-还原成氨[3]，最后用于蛋白质的合成。因此NR 和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)对氮代谢的进行至关重要。然而盐碱胁迫会降低NR 和GS 的活性，改变植物中含氮化合物的含量，最终导致对氮的吸收与利用率下降。近年来，在小麦(Triticum aestivum)[4]、黄瓜(Cuccumis sativus)[5]、水稻(Oryza sativa)[6]以及马铃薯(Solanum tuberosum)[7]等植物中的研究发现氮素与盐碱胁迫有交互关系，植株可以通过累积体内可溶性蛋白和氨基酸等一些小分子有机物缓解盐碱带来的不利影响。其中可溶性蛋白除参与渗透调节外，还在一定程度上代表植物器官功能的变化；氨基酸含量的增加也能调控植物渗透势，提高植物抗盐碱能力，植物也可通过改善NR、GS、谷氨酸合成酶(glutamate synthase, GOGAT)活性等方法提高植物对盐碱胁迫的耐受性。

一氧化氮(nitric oxide，NO)作为生物体内传递细胞间和细胞内信息的信使分子，对提高植物抗逆性方面有重要的功能。目前已经在盐地碱蓬(Suaeda liaotungensis)[8]和甜瓜(Cucumis melo)[9]等植物上得到验证。然而，目前对于藜麦的抗盐碱性研究主要集中在其单盐的生理特性等方面，NO 调控其幼苗抗盐碱性还鲜有报导。因此，本研究以‘陇藜4 号’为试验材料，NO 供体硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)为信号物质，探讨NO 对混合盐碱胁迫下藜麦幼苗生长及氮代谢的影响，以期为揭示藜麦抗盐机理和提高藜麦抗盐性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理方式

试验材料采用甘肃省农业科学研究院提供的白藜麦种子‘陇藜4 号’。选取颗粒饱满、大小均匀、重量一致、品质优等的藜麦种子。使用浓度为10%的次氯酸钠溶液对筛选好的藜麦种子消毒处理15～20 min[10-11]，然后用去离子水洗去残留的次氯酸钠溶液，清洗3 次后，将藜麦种子均匀地播种到深5 cm 的32 孔育苗托盘中(每孔一粒种子)，在温度为25 ± 2 ℃，光照强度为4 000 lx，16 h 光培养/8 h暗培养，相对湿度为85%的环境下进行育苗[12-14]，待长至四叶一心期后，移栽到装有500 g 的经高压灭菌的营养土的花盆(φ = 20 cm，h = 14 cm)中[15]，每盆各移植5 棵藜麦幼苗，每天使用称重法补充水分。继续培养到八叶一心时期[16]，挑选出长势一致的幼苗进行盐碱胁迫及外源NO 处理。

本试验混合盐碱溶液的比例及浓度参考根据文献[17-18]，采用两种中性盐(NaCl、Na2SO4)和两种碱性盐(NaHCO3、Na2CO3)调配成由A 到E 碱性依次 增 强 的 200 mmol·L-1混 合 盐 碱 溶 液(表1)，外 源NO 供体SNP 浓度为150 μmol·L-1。试验处理如下：CK (浇灌蒸馏水)；盐碱胁迫(A、B、C、D、E)；NO；盐碱(A、B、C、D、E) + NO，每处理重复3 次，每2 d施加80 mL 处理液(根据王宝强等[18]的试验方法进行适当调整)，并于混合盐碱处理后3、6、9 d 取样测定株高、根长、生物量、根冠比、NR 活性、GS 活性、可溶性蛋白含量、游离氨基酸含量。

表1 各种处理的不同盐分组成Table 1 Different salt compositions in various treatments

1.2 试验测定指标与方法

1.2.1 盐胁迫下外源NO 对藜麦幼苗生长指标的测定

每种处理选取5 盆长势一致的藜麦幼苗进行破坏性采样，将植株完整挖出，用去离子水洗净根部泥土，用纸巾吸干藜麦幼苗表面水分，进行株高[19]、根长[20]的测量。将藜麦幼苗的茎、叶与根，置于烘箱中，于105 ℃恒温30 min 后，在70 ℃的温度下烘烤至重量恒定不变时，取出用电子秤称量干重，茎与叶的干重之和即为地面上部生物量，根部的干重为地面下部生物量[21]。

总生物量 = 地面上部生物量 + 地面下部生物量[22]；

植株根冠比(R/S) = 地面下部生物量/地面上部生物量[23]

1.2.2 盐胁迫下外源NO 对藜麦幼苗氮代谢相关合成酶活性和含氮化合物含量的测定

采用比色法测定样品中NR 的活力[24]。采用三氯化铁比色法测定样品中GS 活性[25]。采用分光光度法测定样品中游离氨基酸总量[26]。采用考马斯亮蓝法测定样品中可溶性蛋白含量[27]。

1.3 数据分析

采用Excel 2016 软件对试验数据进行处理及图表制作，采用SPSS 22.0 软件的邓肯氏新复极差法对试验数据进行统计学分析，差异显著性水平为 0.05。

2 结果与分析

2.1 盐碱胁迫下外源NO 对藜麦幼苗株高的影响

2.1.1 盐碱胁迫下外源NO 对藜麦幼苗株高的影响

在没有添加外源NO 处理的情况下，随着盐碱处理溶液pH 的上升，藜麦的株高受到明显地抑制，伴随着植物的生长，株高整体呈增长趋势，伴随着时间的推移，藜麦幼苗中盐碱不断堆积，受抑制程度呈现增强趋势 (P< 0.05) (表2)。其中pH 为10.53(E 处理)处理9 d 时对藜麦幼苗株高生长造成的伤害最大，与CK 相比降低了22.73%。外源NO 有效缓解了混合盐碱对藜麦幼苗的抑制作用。外源NO 对藜麦幼苗株高的生长有促进作用，尤其对盐碱的缓解作用更明显，且对碱性盐的效果较中性盐、弱碱性盐明显(表2)。6 d 时缓解效果最佳，其中6 d 时的pH 为9.75 (D 处理)和pH 为10.53 (E 处理)缓解效果最好，与未添加NO 的处理相比，株高分别增加了18.75%和26.00%。表明盐碱会明显抑制藜麦幼苗株高的生长，且会随着盐碱程度的增强、处理时间的推移，受抑制程度增加，外施NO 可以很好地缓解盐碱胁迫的抑制作用。

表2 外源NO 对盐碱胁迫下藜麦幼苗株高的影响Table 2 Effects of exogenous NO on the plant height of quinoa seedlings under saline alkali stress cm

2.1.2 盐碱胁迫下外源NO 对藜麦幼苗根长的影响

随着藜麦的生长发育，其根长呈增长趋势。在面对不同比例的盐碱胁迫时，初期(3 d 时)根部生长受抑，随着处理时间增加，根长呈增长趋势，且在pH 不超过9.18 (A、B、C 处理)时，增加趋势更明显。其中9 d 时pH 为8.98 (B 处理)与CK 相比变化最明显，根长增加了78.79%，表明盐碱胁迫下藜麦幼苗的根长在初期呈降低趋势，随着处理时间增加，藜麦幼苗受盐碱胁迫的刺激作用，根长呈现出一定程度的增加，以缓解盐碱对藜麦幼苗的伤害，这种现象在中性盐和弱碱性(pH ≤ 9.18)盐处理下比较明显(表3)。在喷施NO 处理后，根长整体呈现出增长的趋势，在6 d 时效果最佳(表3)。NO 对碱性盐的效果优于中性盐的效果，尤其是对pH 为9.89 (D 处理)的效果最佳，在6 d 时根长相对于没添加NO 的处理增加了111.11%，表明NO 可明显缓解混合盐碱对藜麦幼苗根部的抑制作用，以维持根系的生长。

2.1.3 盐碱胁迫下外源NO 对藜麦幼苗生物量的影响

所有处理藜麦幼苗的生物量随时间推移而不断增多 (表4)。随着盐碱胁迫中碱性的加剧，幼苗中生物量呈下降趋势。在9 d 时pH 为10.53 (E 处理)碱性最强时生物量下降最明显，与CK 相比降低了61.76%。外源NO 可有效缓解盐碱胁迫造成的伤害，提高藜麦幼苗中的生物量。经过外源NO 处理后，藜麦幼苗中的生物量呈现出增长的走势。NO 对盐碱的缓解效果整体为D > C > B > E > A，在6 d 时效果最佳C 处理和D 处理作用最明显，分别提高了264.29%和340.00% (表4)。

2.1.4 盐碱胁迫下外源NO 对藜麦幼苗根冠比的影响5 种混合盐碱溶液处理下，藜麦幼苗的根冠比呈上升趋势，并随着处理时间的推移和处理溶液碱性的增强上升趋势愈发明显 (表5)，说明盐碱胁迫会使藜麦幼苗的根冠比增高。其中pH 为10.53 时(E 处理)在9 d 的时变化最明显，较CK 提高了195%。外源NO 可以有效缓解混合盐碱胁迫对藜麦幼苗的损伤，使幼苗根冠比增加。NO 处理后，藜麦幼苗中的根冠比有明显增加，并随时间的推移，变化趋 势越明显，表现为C > D > E > B > A。9 d 时，pH 为9.18 (C 处理)的根冠比涨幅最明显，较没有添加NO 的C 处理增加了164% (表5)。

表5 外源NO 对盐碱胁迫下藜麦幼苗根冠比的影响Table 5 Effects of exogenous NO on root to shoot ratio of quinoa seedlings under saline alkali stress

2.2 盐碱胁迫下外源NO 对藜麦幼苗氮代谢相关合成酶活性以及含氮化合物含量的影响

2.2.1 对NR 活性的影响

随着处理天数的增加，藜麦幼苗中的NR 活性呈现出先增高后降低的趋势。盐碱胁迫会让藜麦幼苗中NR 活性下降(6 d 的A 处理除外，与CK 相比，其NR 活性提高了18.18%)，并伴随着盐碱胁迫程度的加深，下降程度更加明显。在pH ≥ 9.75 (D 处理与E 处理)时，藜麦幼苗中NR 活性降低的最明显，与CK 相比分别降低了27.27%和29.09% (图1)。说明盐碱胁迫会明显抑制幼苗中硝酸还原酶的活性，抑制程度伴随碱性的增强而增加。A 处理说明在中性盐的胁迫下，藜麦幼苗中NR 的活性因受盐碱的刺激作用，使NR 活性增强，抵抗盐碱胁迫，但随着处理时间的增强，酶活性也呈降低趋势。

图1 外源NO 对盐碱胁迫下硝酸还原酶活性的影响Figure 1 Effect of exogenous NO on nitrate reductase activity under saline alkali stress

添加NO 可以有效缓解盐碱胁迫，对NR 活性的缓解作用随处理时间的推移而增加，表现为D >B > C > E > A。施加外源NO 9 d 时，藜麦幼苗中的NR 均有明显上升，在pH 为9.89 (D 处理)时上升了51.52%，效果最佳(图1)。说明外源NO 对混合盐碱胁迫存在一定的缓解作用，可有效增加藜麦幼苗中硝酸还原酶活性，尤其是在面对碱性盐时，硝酸还原酶活性有明显的上升。

2.2.2 对GS 活性的影响

混合盐碱明显降低了GS 的活性，随时间的推移其活性逐渐下降，且与中性盐相比，碱性盐对GS 活性的抑制程度更明显。说明盐碱胁迫可明显抑制GS 活性，抑制程度与处理液碱性强度呈正相关关系。在9 d 时，pH 为8.98 和9.89 (B 处理和D 处理)时抑制效果最明显，GS 活性与CK 相比分别降低了73.22%和70.56% (图2)。

图2 外源NO 对盐碱胁迫下藜麦幼苗中谷氨酰胺合成酶活性的影响Figure 2 Effect of exogenous NO on glutamine synthetase activity in quinoa seedlings under saline alkali stress

外源NO 处理后，对GS 活性的缓解作用随时间推移而增加：9 d > 6 d > 3 d (图2)。GS 活性的缓解作用表现为D > C > E > B > A，可以看出对碱性盐的缓解作用优于中性盐。在9 d 时，外源NO 在pH 为9.89 (D 处理)时缓解作用最强，GS 活性相对没有添加NO 的处理提高了83.08%。说明外源NO 在一定程度上可以缓解盐碱胁迫对幼苗中GS 活性的抑制作用，增强GS 活性。

2.2.3 对可溶性蛋白含量的影响

在混合盐碱溶液的处理下，藜麦幼苗中可溶性蛋白的含量随时间和碱性的增强整体呈现上升趋势，在盐碱处理3 d 时，在pH 为9.18 和10.53 (C 处理和E 处理)时藜麦幼苗中可溶性蛋白的含量分别提高了22.27%和19.33%，变化最明显(图3)。

图3 外源NO 对盐碱胁迫下藜麦幼苗中可溶性蛋白含量的影响Figure 3 Effect of exogenous NO on soluble protein content in quinoa seedlings under saline alkali stress

在施加外源NO 处理后，藜麦幼苗中的可溶性蛋白含量呈现出降低的趋势，并随着处理天数的增加，变化程度越发明显(图3)。表明外源NO 溶液可以减少藜麦幼苗中可溶性蛋白的含量。施加了外源NO 后，pH 为9.18 (C 处理)时，在9 d 时藜麦幼苗中可溶性蛋白含量减少量最显著，相对降低了37.35%。

2.2.4 对游离氨基酸总含量的影响

藜麦幼苗中游离氨基酸含量受到盐碱胁迫后会呈现出一定程度的上升，并且伴随着碱性的加强、处理时间的延长游离氨基酸的含量增加量越多，这说明受盐碱条件的影响，藜麦幼苗中游离氨基酸的含量会增加，并与碱性的强弱成反比。在盐碱处理的下，pH 为10.53 (E 处理)在3 d 和6 d 时，藜麦幼苗中游离氨基酸的含量增加最明显，与CK 相比分别提高了30.75%和28.67% (图4)。

图4 外源NO 对盐碱胁迫下藜麦幼苗中游离氨基酸总含量变化的影响Figure 4 Effect of exogenous NO on the total content of free amino acids in quinoa seedlings under saline alkali stress

经外源NO 处理后，藜麦幼苗中游离氨基酸的含量呈现出明显的增长趋势，表现为D > C > E > B >A (图4)。pH 为9.89 (D 处 理) 3 d 时 在 施 加 了 外 源NO 溶液处理后，上升幅度最大，效果最明显，游离氨基酸含量相对未添加NO 的处理增长了47.74%。在9 d 时，pH 为9.18 (C 处理)中游离氨基酸含量增加的最明显，相对增长了46.77%。说明外源NO 可以促进氮代谢，有利于游离氨基酸的积累。

3 讨论

3.1 盐碱胁迫下外源NO 对藜麦幼苗生长指标的影响

盐胁迫会明显影响植株的正常生长发育，主要表现在植物组织和器官生长方面。生长状态是反映植物受盐碱胁迫程度情况的一个基本指标[28]。本研究表明，不同程度的盐碱胁迫均抑制藜麦的生长，当盐碱浓度增加时，所表现出的抑制作用逐渐明显。与在玉米(Zea mays)、水稻、樱桃(Cerasus pseudocerasus)、番茄(Solanum lycopersicum)等植物中的研究类似[29-32]，盐碱胁迫会明显抑制植物的生长。本研究也发现在盐碱胁迫的条件下，藜麦幼苗的株高、根长、生物量和根冠比与对照相比有显著变化，株高与生物量呈现明显下降的趋势，根长与根冠比呈现上升的趋势。说明受盐碱胁迫的影响，植物的地上部分的生物量和株高会降低，以减轻对营养物质的消耗，会增加自身根部的长度和生物量作为保护手段，从而增多对土壤中水分、氮源、碳源等营养物质的吸收，以维持植株的正常生长发育，从一定程度上抵制盐碱胁迫。

NO 作为植物体内的信号分子，组成植株中的转导路径，调节植物应对环境中的生物胁迫与非生物胁迫。外源NO 对植物生长的促进作用以及其参与抗逆耐受等生理过程，目前已经在高粱(Sorghum bicolor)[33]、玉米[31]、马铃薯[7]等植物中被证实。本研究表明施加了外源NO 后，较好地缓解这一状况，株高、生物量、根长和根冠比皆呈现出增长趋势，NO 的缓解效果对强碱性盐C、D 的缓解作用更强，这与刘建新等[34]在黑麦草(Lolium perenne)幼苗和吴旭红等[35]在南瓜(Cucurbita moschata)幼苗研究中的情况一致。因此我们推测在施加了外源NO后，会增加根生组织的发育，增加养分的吸收，提高地上部分的发育，让藜麦幼苗的生长状态恢复正常水平，以缓解盐碱胁迫带来的土壤水势降低、吸水困难的问题。

3.2 盐碱胁迫下外源NO 对藜麦幼苗氮代谢相关合成酶活性以及含氮化合物含量的影响

氮代谢是植物体内的重要生理过程之一，主要通过吸收无机氮(NO3－)，同化为有机含氮化合物，提高植物在逆境中的耐受性，其中NR 和GS 的活性代表着氮代谢转化的程度[34-37]。盐碱胁迫会引起其活性下降，导致细胞质中反应物硝酸盐的堆积及反应产物亚硝酸盐含量的减少，引起氮代谢紊乱，最终影响植物的正常生命活动。本研究结果表明，在盐碱胁迫下，藜麦幼苗中的NR 活性随处理天数增加呈现出先增后减的趋势，NR 活性表现为6 d > 3 d >9 d，GS 活性随处理时间的推移以及处理液中碱性的增强而下降，且在pH > 8.9 (B、C、D、E 处理)的碱性盐环境中，GS 活性下降的幅度最明显，这与刘月月等[4]在水稻中的研究相似，这说明盐碱胁迫会抑制NR 和GS 的活性，NR 活性随处理时间增加先增后减，对其抑制程度与pH 成正比，盐碱胁迫会对细胞中硝酸盐的转化，影响NO3-的转化利用，伴随着pH 的变大，GS 活性被抑制的程度不断加深，从而影响氮素同化，NO3－同化和蛋白质降解产生的N积累引起氨中毒，阻碍植物正常生命活动的进行。

在施加外源NO 后，NR 和GS 活性整体呈现出上升的趋势，其中在pH 为9.75 (D 处理)时效果最佳，证明外源NO 可有效缓解盐碱NR、GS 活性的抑制作用，且对碱性盐的缓解作用较中性盐明显，这说明喷施NO 能促进盐碱胁迫下藜麦幼苗对硝酸盐的转化。NR 活性越高对硝酸根的转化效率越高，主导着作物对氮素的吸收和利用，提升氮代谢的效率，以维持作物正常的生长发育。GS 活性提升，提高对NH4＋的转化效率，避免造成植物氨中毒，维持植物正常生理活动。

氨基酸的合成受到NR 和GS 活性的调控，与蛋白质的降解密切相关。可溶性蛋白是植物体内氮素存在的主要形式，植物可以通过提升可溶性蛋白的含量来提高细胞的保水能力，以缓解伤害。本研究表明：伴随着盐碱程度的提升，藜麦幼苗中氨基酸含量不断提高，可溶性蛋白含量呈先增后减的趋势，说明盐胁迫破坏了植物细胞结构，导致构成细胞的可溶性蛋白流出，可溶性蛋白的分解会产生大量的游离氨基酸，这不仅有利于植株进行渗透调节，还有益于维持植株氮代谢的正常进行，与吴旭红等[35]对南瓜幼苗和陈明等[38]在小麦幼苗方面的试验结果相似。施加NO 后，藜麦幼苗中可溶性蛋白含量降低，氨基酸含量整体呈上升趋势，说明外源NO 会通过修复盐碱胁迫所造成的氧化性损伤，加快对NO3－的转化吸收，进而增加NR 和GS 的活性，增加游离氨基酸的积累，减少可溶性蛋白的含量，消除盐碱胁迫下对氮代谢及相关代谢酶的毒害作用。

4 结论

盐碱对藜麦幼苗的生长和氮代谢具有明显的抑制作用，NR 和GS 活性显著降低，游离氨基酸和可溶性蛋白的含量呈上升趋势；外源NO 对盐碱胁迫有明显的缓解作用，可以通过增加藜麦幼苗的根长，增加对土壤中营养物质的吸收，从而使地上部分的生长水平趋于正常状态；还可以加强氮代谢相关合成酶活性，使游离氨基酸含量呈现上升趋势、可溶性蛋白含量呈下降趋势，介导藜麦幼苗的氮代谢，进而有效地缓解混合盐碱的胁迫作用，降低其对生长和氮代谢的抑制。外源NO 对D (NaCl ꞉Na2SO4꞉ NaHCO3꞉ Na2CO3= 1 ꞉ 1 ꞉ 1 ꞉ 1)处理的效果最理想，但pH 超过10 后(E 处理)效果会下降，进一步说明外源NO 对碱性盐胁迫的缓解作用效果较中性盐更显著，对pH 在10 左右的盐碱作用最佳，可以明显地缓解盐碱对生长、氮代谢的抑制作用。