H2O2 处理修复老化油莎豆的生理机制

李金珠，张学昆，徐劲松，谢伶俐，许本波

（1.长江大学生命科学学院, 湖北 荆州 434025；2.长江大学农学院, 湖北 荆州 434025）

油莎豆(Cyperus esculentus)，又名人参果、油莎草、虎坚果等，属莎草科草本油料作物[1]，原产于非洲地中海地区，现非洲、欧洲、亚洲、北美洲和拉丁美洲的热带、亚热带和温带地区均有分布[2]，具有产量高、适应性广、抗逆性强等特点，地下块茎(干豆)产量在7500～9000 kg·hm-2，含油量20%～25%，且油莎豆油富含多种维生素和不饱和脂肪酸，综合营养价值媲美橄榄油[3]。另外，油莎豆适宜在较贫瘠土地种植，已成为我国近年大力推广的新型油料作物之一，被列入《全国种植业结构调整规划(2016－2020 年)》推荐作物品种[4]。

种子收获后要经历晒干贮藏的步骤，通常把贮藏超过一年以上的发生自然老化的种子称为陈种子[5]。老化的种子会表现出活力下降、发芽迟缓、在萌发过程中抗逆能力差、幼苗生长弱且畸形率高、植株生长缓慢等不可逆转的质量下降现象[5-6]。种子老化是一个逐渐发生的过程，老化速度和程度受到多种因素影响，如贮存温度、种子含水量等[7-8]。Mcdonald[9]认为种子劣变是由于种子内部自动氧化或由氧化酶的催化产生的自由基攻击脂类物质，造成脂类物质过氧化的结果。施加外源物质处理是一种提高老化种子萌发的有效方法，通过外源物质处理使种子的细胞膜系统得到修补，种子活力提高，有利于萌发期间各项生理活动顺利进行。目前，水杨酸(salicylic acid, SA)、赤霉素(gibberellins,GA)、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)等已被用于陈年老化种子的处理[10-11]。过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)是一种活性氧(reactive oxygen species, ROS)分子，为细胞代谢的产物，具有重要的生理功能，如促进种子发芽，提高种子萌发过程中的抗逆性等，同时，H2O2作为一种重要信号分子，可以调控植物体内系列的生理生化反应以减轻逆境伤害[12]。已有研究表明H2O2可作为外源物质对作物生长产生影响，比如，陈种子新陈代谢系统的修复[13]、参与根系形态建成的调节等[14]。

长江大学油料作物团队前期研究发现油莎豆块茎不耐储藏，储藏过程中种子活力下降迅速，甚至容易霉变失活。因此，长江大学油料作物研究团队开展了H2O2处理对老化油莎豆修复的研究，以期明确H2O2处理修复老化油莎豆、促进萌发的生理机制，为油莎豆陈种子的开发利用及油莎豆高效栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021 年在长江大学生命科学学院实验室进行。供试圆粒型油莎豆为常温贮存两年的老化块茎，由长江大学油料作物团队提供；供试药品购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验设计

选择大小均一、饱满一致、无病斑、无机械损伤的自然老化两年的油莎豆块茎，流水冲洗干净后用0.5%次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗3 遍。消毒后的块茎分别用 H2O (对照，T0)、0.01% H2O2(T1)、0.1% H2O2(T2)、1% H2O2(T3)、3% H2O2(T4)、5%H2O2(T5)遮光浸种72 h。浸种结束，将块茎均匀置于垫有两层滤纸的培养皿中，每个培养皿中放置20 个块茎，在温度35 ℃，16 h 光照/8 h 黑暗，光强52 μmol·(m2·s)-1，相对湿度为80%的条件下培养，每个处理重复3 次。每天定量补充蒸馏水，保持滤纸湿润，2 d 更换一次滤纸。

1.3 指标测定与方法

1.3.1发 芽指标测定

将3 次重复中有1 个块茎萌发时作为该处理下发芽的开始，调查每个处理的发芽数，连续3 d 不再有块茎发芽作为发芽的结束。统计每日发芽数、总发芽数，并计算以下指标：

式中：G10为第10 天正常发芽的块茎数；G5为第5 天正常发芽的块茎数，N为供试块茎总数；Gi为i日的发芽数，Di为相应时间的发芽天数；Gt为t日发芽块茎数，Dt相应发芽天数。

1.3.2 农 艺性状测定

萌发试验结束后，从每个处理中随机选取10 株幼苗，去离子水冲洗干净后吸干表面水分，测定芽及根长度；然后分别切取根和芽，天平称量鲜重；再将芽和根置于烘箱105 ℃杀青30 min，80 ℃下烘干至恒重，天平称量其干重，计算根冠比及干物质转换率。

根冠比 = (根干重/芽干重) × 100%；

干物质转运率 = [(芽干重 + 根干重)/(芽干重 +根干重 + 种子干重)] × 100%。

1.3.3 生 理指标测定

萌发试验结束后，从每个处理中随机选取油莎豆，去离子水冲洗干净后吸干表面水分，切取块茎用液氮速冻，并于-80 ℃保存备用，用于相关生理指标测定。每个处理4 次生物学重复，3 次技术性重复。

可溶糖含量测定参考杨志敏[15]的方法稍作改动。取0.1 g 样品于2 mL 离心管中，加入1 mL 去离子水，研磨成匀浆后转入10 mL 离心管，沸水浴10 min，冷却过滤，定容至100 mL。取待测样品提取液1 mL，加1 mL 去离子水和0.5 mL 蒽酮试剂，混匀后再缓慢加入5 mL 浓硫酸，摇匀后沸水浴10 min，冷却至室温，620 nm 波长下测定吸光度。

可溶性蛋白含量测定参考邹琦[16]的方法稍加改动。取0.1 g 样品于2 mL 离心管中，加入1 mL 去离子水研磨成匀浆，常温下4000 r·min-1离心10 min，取上清液，定容至10 mL。取0.1 mL 样品提取液，加0.9 mL 去离子水，5 mL 考马斯亮蓝G250 充分混匀，2 min 后595 nm 波长下测定吸光度。

过氧化氢酶(catalase, CAT)采用紫外吸收法测定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)采用氮蓝四唑(nitro-blue tetrazolium, NBT)光还原法测定；淀粉酶采用紫外吸收法测定；丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定[17]。

1.3.4 激 素含量测定

采用甲醇浸提法提取植物激素，高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定内源激素GA3、脱落酸(abscisic acid, ABA)的含量[18]。流动相为甲醇和1%的乙酸溶液(甲醇 ꞉ 乙酸溶液 =45 ꞉ 55)，柱温为28 ℃，流速为1 mL·min-1，检波为254 nm，进样量10 μL。取样方法与生理指标测定相同。

1.4 灰色关联度分析及数据处理

参照胡亚丽等[19]方法，对H2O2处理浓度和老化油莎豆修复关联程度做灰色关联度分析。发芽率为参考数列X0，10 个生理指标设为比较数列Xi，参数X0和Xi的关联系数和各因素的关联程度分别为：

采用Excel 进行原始数据录入、计算和整理，利用DPS 7.05 数据处理系统进行统计分析，Craphpad prism 8 软件进行作图。处理间比较采用最小显著差异法(least significant difference, LSD)。

2 结果与分析

2.1 H2O2 处理对老化油莎豆萌发的影响

与T0相比，随着H2O2浓度的升高，发芽率、发芽势及发芽指数呈先上升后降低的趋势(表1)。其中H2O2浓度为1%时效果最好，发芽率、发芽势、发芽指数分别比T0显著提高了300.12%、400.00%、458.88% (P< 0.05)。经H2O2处理后平均发芽天数略小于T0，但差异不显著(P> 0.05)。综上，H2O2处理有利于提高老化油莎豆的萌发能力，其中T3处理效果最佳。

表1 H2O2 处理对老化油莎豆萌发状况的影响Table 1 Effect of H2O2 treatment on the germination status of aged Cyperus esculentus

2.2 H2O2 处理对老化油莎豆农艺性状及干物质转化的影响

农艺性状随H2O2浓度的升高呈先上升后降低的趋势(表2、图1)。芽长、叶片数、根长、须根数、根冠比和干物质转化率在T3时达到最大，分别较T0显著增加484.65%、700.00%、2 057.8%、2 031.76%、483.48%、746.20% (P< 0.05)。表明H2O2处理促进油莎豆幼苗的生长，在T3时效果最为明显。

图1 H2O2 处理对老化油莎豆幼苗生长的影响Figure 1 Effects of H2O2 treatment on the growth of aged Cyperus esculentus seedlings

表2 H2O2 处理对老化油莎豆农艺性状的影响Table 2 Effect of H2O2 treatment on the agronomic traits of aged Cyperus esculentus

2.3 H2O2 处理对老化油莎豆发芽过程中抗氧化酶活性及MDA 含量的影响

不同H2O2处理下CAT、SOD 活性均高于T0，且随着H2O2浓度的升高呈先上升后下降的趋势，其中T3的CAT、SOD 活性增幅最大，分别比T0显著增加了188.35%、348% (P< 0.05)。H2O2处理显著降低了油莎豆块茎中MDA 的含量，T1～T5分别比T0降低了27.48%、34.96%、46.58%、50.58%和25.17%(P< 0.05)，表明H2O2处理通过降低油莎豆块茎中MDA 含量，提高CAT 和SOD 酶活性，以提高细胞膜的稳定性，利于细胞膜的修复(图2)。

图2 H2O2 处理对老化油莎豆萌发过程中抗氧化酶活性及MDA 含量的影响Figure 2 Effects of H2O2 treatment on antioxidant enzyme activity and malondialdehyde (MDA)content during germination of aged Cyperus esculentus

2.4 H2O2 处理对老化油莎豆发芽过程中可溶性蛋白、可溶性糖含量的影响

种子萌发时，会消耗种子内部的可溶性糖和可溶性蛋白，随着H2O2浓度的上升，可溶性蛋白和可溶性糖含量均呈现先上升后下降的趋势，其中T3的可溶性蛋白和可溶性糖含量达到最高，分别比T0显著增加62.97%和204.97% (P< 0.05) (图3)。说明H2O2处理有利于增强老化油莎豆内在物质转化和合成能力，提高营养物质的利用效率。

图3 H2O2 处理对老化油莎豆萌发过程中可溶性蛋白、可溶性糖含量的影响Figure 3 Effects of H2O2 treatment on soluble protein and soluble sugar content during germination of aged Cyperus esculentus

2.5 H2O2 处理对老化油莎豆发芽过程中淀粉酶活性的影响

随着H2O2浓度的升高，淀粉酶活性呈先降低再升高的趋势。与T0相比，T1、T2和T3的α-淀粉酶活性比T0分别降低了13.55%、23.73%和0.33%，T4和T5比T0分 别 提 高 了32.41%和37.66%；T1、T2和T3的β-淀粉酶活性比T0分别降低了23.57%、26.92%和21.25%，T4和T5比T0分别提高了6.73%和3.92%；T1、T2、T3和T5的总淀粉酶活性分别比T0降低了28.71%、32.72%、25.09%和0.03%，T4比T0提高了1.16%，其中T1、T2、T3处理显著低于T0(P< 0.05)(图4)。表明H2O2处理可通过调节老化油莎豆中淀粉酶活性来影响老化油莎豆的萌发。

图4 H2O2 处理对老化油莎豆萌发过程中淀粉酶活性的影响Figure 4 Effect of H2O2 treatment on amylase activity during germination of aged Cyperus esculentus

2.6 H2O2 处理对老化油莎豆发芽过程中GA3、ABA 含量及GA3/ABA 比值的影响

随着H2O2浓度的上升，GA3含量呈先上升后下降的趋势，在T3时增幅最大，比T0显著增加了157.04% (P< 0.05)；ABA 含量呈持续上升趋势，其中T3、T4和T5分别比T0显著增加了86.79%、94.19%和122.25% (图5)。

图5 H2O2 处理对老化油莎豆萌发过程中GA3、ABA 含量及GA3/ABA 的影响Figure 5 Effects of H2O2 treatment on gibberellins (GA3), abscisic acid (ABA) content and GA3/ABA during germination of aged Cyperus esculentus

不同处理下GA3/ABA 均高于T0，且随着H2O2浓度的升高呈先上升后下降的趋势，其中T4处理时GA3/ABA 增幅最大，比T0显著增加了125% (P<0.05)，表明H2O2浸种通过调节油莎豆中GA3/ABA来维持内源激素平衡，调节物质合成与分解，从而提高种子活力，促进萌发(图5)。

2.7 H2O2 处理对老化油莎豆修复指标灰色关联度分析

以发芽率为参考数列，对H2O2处理修复后各生理生化指标做灰色关联度分析，其关联顺序依次为GA3> SOD > 可溶性糖 > GA3/ABA > ABA > CAT >可 溶 性 蛋 白 > α-淀 粉 酶 > 总 淀 粉 酶 > β-淀 粉 酶 >MDA (表3)。其中，GA3含量与发芽率的灰色关联度最高，说明GA3含量可作为H2O2处理修复老化油莎豆效果的指示指标。

表3 H2O2 处理对老化油莎豆修复的生理生化指标灰色关联度分析Table 3 Grey correlation analysis of the physiological and biochemical indexes of H2O2 treatment for the repair of aged Cyperus esculentus

3 讨论

3.1 H2O2 处理对老化油莎豆萌发及生物量的调控

种子是植物的主要繁殖器官，种子质量的优劣关系着种苗的培育及种质资源的安全贮藏。种子在生理成熟之后活力逐渐减弱，利用外源物质处理是提高老化种子活力的一种有效的方法。H2O2可使种皮软化，促进种皮的通气透水性，还可分解生成O2，使O2和H2O 能顺利透过种皮到达种胚，并进一步激活种子内部酶的活性[20]。H2O2还可直接作为植物体内的信号分子和活性氧分子，诱导多种相关基因的表达，联合其他激素共同作用，提高相关酶活性，促进种子的萌发[21-22]。本研究结果与上述结论基本一致，H2O2处理有效修复老化油莎豆，提高油莎豆块茎活力，促进萌发。

根系是植物从土壤中吸取水分和养分的重要器官，根系越长、数量越多吸水能力越强。研究认为根系形成对植物的发育至关重要，若根系发育不良或生理功能失调，会严重影响植株的生长发育[23]；适当浓度H2O2能促进苦瓜(Momordica charantia)陈种子的根的伸长[13]。这些研究表明，H2O2对调节植物根系的生长发育和产量形成起关键作用。油莎豆整个生长阶段只有须根而无主根，H2O2处理后根长、须根数量、根冠比都大幅度增加，与上述结论基本一致。

干物质积累和转运本身是一个动态过程，对植物籽粒的形成有直接或间接贡献。小麦(Triticum aestivuml)营养器官中的干物质的转运、分配是小麦籽粒产量的重要来源，促进小麦花前贮藏物质的转运，可有效提高小麦籽粒产量[24]。谷子(Setaria italica)生产中，一定程度上提高营养器官干物质的转运率，是实现谷子产量大幅度提高的有效途径[25]。适宜浓度的H2O2处理可以修复小麦种子因老化造成的幼苗生长量下降，显著提高正常生长状态幼苗的生物量[11]。以上研究表明，干物质转运和积累是植物产量形成的关键因素，结合本研究结果，H2O2处理后干物质转运率大幅度增加，其中在H2O2浓度1%时达到最大。

3.2 H2O2 处理对老化油莎豆块茎中渗透物质含量的调控

可溶性蛋白和可溶性糖是植物体内重要的营养物质和有机渗透调节物质，多数可溶性蛋白是参与各种代谢的酶类，其含量变化能够反映种子生命活动的强弱；可溶性糖可为呼吸作用提供底物，还可以转化为植物体内的储存物质和结构物质[26]，并具有降低细胞的渗透势、维持细胞质和液泡间的渗透平衡、保护细胞膜结构的完整性和反映种子能否顺利萌发和生长的作用[22]。研究表明，老化小麦种子可溶性糖含量呈递减趋势，可溶性蛋白变化趋于复杂，没有明显的规律性[27]；外源施加H2O2可提高燕麦(Avena nuda)幼苗叶片的可溶性糖、可溶性蛋白质含量[28]。上述结果与本研究结果一致：经过H2O2处理老化的油莎豆块茎中代谢水平加强，可溶性糖、可溶性蛋白含量上升，为幼苗的形态建成提供了足够的底物和能量。

3.3 H2O2 处理对老化油莎豆块茎中抗氧化酶活力及MDA 的调控

植物受到外在胁迫时体内ROS 含量增加，ROS会引起细胞老化，对细胞造成伤害，因此植物会形成复杂的ROS 清除系统来减轻植物的氧化损伤[29]。李琳等[30]研究表明外源H2O2能提高CAT 和SOD的活性，促进蓝藻(Cyanobacteria)体内ROS 的清除，降低膜脂质过氧化损伤；也有研究发现外源H2O2处理可软化小麦陈种子种皮，增加种子对H2O和O2的吸收，增强呼吸作用，促进贮藏物质转化为小分子物质，提升小麦陈种子发芽率[31]。本研究与上述结论基本一致。H2O2处理后老化油莎豆CAT、SOD 活性增强，加快ROS 的清除效率，减轻氧化损伤。

MDA 是细胞膜脂过氧化产物，其含量可以反映植物在胁迫环境中受伤害的程度[7]。在种子老化过程中，脂类物质发生过氧化反应，生成大量脂质自由基和有毒产物，使抗氧化酶活性下降，加速生物膜受损[32]。研究发现MDA 含量与香椿(Toona sinensis)种子老化程度密切相关，且随着贮藏时间的延长逐渐升高[33]。王艳玲等[20]发现适当浓度的H2O2处理后，MDA 含量明显下降，进而减轻了膜脂过氧化作用，维护细胞膜完整性。由此可见，膜脂过氧化会引起种子内部新陈代谢混乱，加速种子老化，适宜浓度的H2O2处理有助于降低植物中的MDA、提高抗氧化酶的活性，对老化种子的修复起到积极作用。本研究也发现适宜浓度的H2O2处理能有效修复油莎豆块茎老化造成的损伤。

3.4 H2O2 处理对老化油莎豆块茎中淀粉酶活力的调控

植物种子萌发过程中，淀粉在淀粉酶的作用下不断分解为种子生长提供能量[34]。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶，对调节和平衡碳水化合物的形态起重要作用，在种子老化过程中，随老化程度的增加，淀粉酶的活性呈下降趋势，施加外源物质能使淀粉酶的活性上升，较高的淀粉酶活性有利于种子在萌发过程中物质和能量代谢的快速启动[35]。不同渗调剂处理对茎瘤芥(Brassica juncea)老化种子淀粉酶活性产生影响，可提高种子活力[36]。外源施加低浓度的H2O2能促进老化甜菜(Beta vulgaris)种子中α-淀粉酶、β-淀粉酶含量持续上升，对种子萌发过程能量的供给起着重要的调节作用，从而提高老化甜菜种子的活力及其抗逆性[37]。本研究发现低浓度H2O2处理，老化油莎豆淀粉酶活性有所下降，这与王慧超等[36]研究结果相近，与荆文旭等[37]的研究结论不太一致，可能与作物种类、H2O2浓度以及种子老化程度有关。

3.5 H2O2 处理通过调控GA3/ABA 修复老化油莎豆

植物种子萌发与内源激素含量的变化密切相关，内源激素通过诱导贮藏物质的分解及合成，最终促使种子发芽[38]。GA 和ABA 是种子萌发过程中起主要调控作用的激素。GA 具有打破种子休眠、促进种子萌发的作用；ABA 具有诱导种子的休眠、抑制种子萌发、维持种子休眠的作用，ABA 在植物遭受逆境胁迫时会积极响应，急剧升高以提高其抗性[26,39-41]。植物生长是由多种植物激素共同作用的结果，有研究表明ABA 和GA 在休眠和萌发中具有重要的拮抗作用，ABA/GA 是植物种子休眠状态的主要调节器[42]。研究表明PEG 和GA3引发处理提高老化毛竹(Phyllostachys pubescens)种子中GA3含量，降低ABA 含量，使GA3/ABA 的比值增加，从而种子的活力水平显著提高[43]。山桐子(Idesia polycarpa)种子中GA3/ABA 的增加有助于提高种子的萌发，提高种子的活力[44]。本研究结果与上述结果基本一致，H2O2处理提高了老化油莎豆块茎中内源激素水平，维持了内源激素的平衡，从而提高了种子活力，促进萌发。

4 结论

H2O2处理能有效修复老化油莎豆，提高老化油莎豆块茎的活力、促进萌发及幼苗根系生长，其中1% H2O2处理效果最好。主要机制是通过调节抗氧化酶的活性提高对ROS 的清除能力；减少块茎中MDA 积累，减弱膜脂过氧化效应；提高老化油莎豆中渗透物质的含量，维持细胞的渗透调节功能；降低块茎中淀粉酶活性，加快储存物质的分解，为萌发提供足够的物质和能量支撑；调控块茎中GA3/ABA，引起油莎豆块茎适应性调节反应，从而在一定程度上增强油莎豆块茎对老化的抵抗能力，进而促进萌发和幼苗的生长(图6)。

图6 油莎豆老化修复调控机制示意图Figure 6 Schematic diagram of the aging repair mechanism of Cyperus esculentus