基于植物学性状分析蝴蝶豆种质遗传多样性

王燕茹，袁秉琛，孙郁婷，李承臻，王志勇，虞道耿

（1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所, 海南 海口 571101；2.海南大学热带作物学院,海南 海口 570228；3.海南大学林学院, 海南 海口 570228）

蝴蝶豆(Centrosema pubescens)是豆科距瓣豆属多年生草质藤本植物，其起源于南美洲，现分布于东南亚，并适合生长在热带、亚热带潮湿或中度湿润地区[1-2]，在我国被引种栽培在广东、海南、台湾、江苏、云南等地。蝴蝶豆主要生长在pH 为4.9～5.5 的肥沃沙壤土，在干旱、酸性、排水不良和低肥力土壤中也可生长[3-5]。蝴蝶豆具有多种特点，包括耐旱、耐阴[6]、适口性好、能固氮等，且具有抵御叶斑病和红蜘蛛侵害的能力，还能抵制杂草的入侵。因此被认为是一种优良的绿肥和覆盖植物，其茎叶还可以用作饲料[7-12]，在热带山区草牧业发展中具重要作用。

蝴蝶豆的茎叶非常嫩，即使在生长了18 个月后仍然没有木质化。其叶数量多，产量高，每年可以产出30～45 t·hm-2；蝴蝶豆的茎叶富含丰富的营养，尤其是高蛋白质，是家畜非常喜欢食用的绿饲料。因此被认为是一种优质的高蛋白质饲料，适用于各种家畜和家禽，包括牛、羊、猪、禽类和兔等。蝴蝶豆与大黍(Panicum maximum)、象草(Pennisetum purpureum)、糖蜜草(Melinis minutiflora)、毛花雀稗(Paspalum dilatatum)和 毛 蔓 豆 (Calopogonium mucunoides)等混播产量、营养价值有所提高。在美国佛罗里达州，如果只种植俯仰马唐(Digitaria eriantha)产量只有5.24 t·hm-2，但是，如果将蝴蝶豆与俯仰马唐混播种植，产草量可增加到9.39 t·hm-2，且俯仰马唐的粗蛋白含量能从6.3%提高到9.9%。此外，在巴西的放牧试验结果显示，在蝴蝶豆和俯仰马唐的混播草地中放牧肉牛的鲜重比单一俯仰马唐草地高17.4%[13]。

植物遗传多样性主要通过稳定且易于区分的遗传标记的多态性来反映。遗传标记的类型包括形态学标记、细胞学标记、生化标记以及分子标记[14]等多种方法，每一种标记方法都有其自身的优缺点[15]。形态学标记通过人眼直接观察植物品质性状得出，与其他标记方法相比，经济、直观，在植物茎、叶、花果等的分类鉴定中，已被广泛使用在南瓜(Cucurbita moschata)[16]、番茄(Solanum lycopersicum)[17]、桑树(Morus alba)[18]、文冠果(Xanthoceras sorbifolium)[19]等物种上。例如，对142 份番茄种质植株、产量、果实和品质等方面的47 个性状进行遗传多样性和相关性分析，发现该种质为自然群体，且遗传变异较丰富。

早在1969 年美国俄克拉荷马州立大学学者根据狗牙根(Cynodon dactylon)的茎、生长习性，叶、株型等性状，将其分为6 个变种，建立了分类学上的骨架[20]。张小艾和张新全[21]研究了西南地区的野生狗牙根的遗传多样性，通过考察20 个综合性状，如种群自然高度、叶长和叶宽等，发现该地区的野生狗牙根具有丰富的遗传多样性，并将其分为4 个主要类别。严琳玲等[22]对76 份山蚂蝗属(Desmodium)种质的32 个形态学指标进行了分析，并将其分为7 类。谢向誉等[23]对31 份木薯(Manihot esculenta)种质资源植物学性状初步鉴定评价，筛选出13 份株型较好的资源。蝴蝶豆表现优良，可在砖壤土里生长，管理粗放、可作饲料、牧草，但目前尚未应用形态学标记对其形态学特征进行遗传多样性研究。

鉴于此，本研究以75 份蝴蝶豆属种质资源为研究材料，将质量性状与数量性状相结合，对38 个植物学性状进行观测，分析其形态学遗传多样性，对蝴蝶豆属种质资源植物学性状及农艺性状进行评价及分类[17]，为选育蝴蝶豆新品种提供候选材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在试验中使用的75 份蝴蝶豆种质，这些种质包括 International Center for Tropical Agriculture(CIAT)引进的国外资源和国内野外收集的资源，涵盖了1 个属(蝴蝶豆属)下的3 个种，分别是蝴蝶豆、大果蝴蝶豆(1 个)、尖叶蝴蝶豆(1 个) (表1)，经纬度及来源如附表1 所列。

表1 供试材料Table 1 Accessions used in this study

1.2 试验方法

1.2.1 田 间试验设计

75 份蝴蝶豆属种质资源种植在海南省儋州市科技园区中国热带农业科学院品资所牧草中心试验基地(19°31′22.63″ N， 109°34′36.00″ E)，试验地为热带季风气候，光热条件好，雨水充沛，雨热同期[24]。砖壤土，pH 4.5，肥力较低。

1.2.2 植物学性状调查及指标

在田间试验中，采用随机区组设计，每个材料小区的种植规格为1 m × 3 m，每个小区种植15 株蝴蝶豆，株距为0.5 m，行距为0.5 m。在蝴蝶豆成熟期(12 月中旬)调查植物学性状，每小区随机抽取5 株。根据《热带牧草种质资源数据质量控制规范》[25](表2)测量蝴蝶豆属种质资源生活型，茎、叶、花、荚果和自然高度等共38 个植物学性状；其中，中央小叶长和小叶宽，叶长度和宽度，荚果长度、宽度和自然高度为数量指标，其余均为质量指标。

表2 蝴蝶豆属种质植物学性状赋值Table 2 Assignment of botanic characters

1.3 数据分析

1.3.1 相 关 遗 传 参 数 计 算

通过调查和统计蝴蝶豆的各项指标，使用Excel软件进行数据处理和分析，得出各种质量性状的分布频率。同时，利用公式计算遗传多样性指数(H)。针对每个植物学性状，计算出其最小值、最大值、极差、平均值、标准差以及变异系数等统计量。使用SPSS 统计软件对38 个植物学性状指标进行Pearson相关性分析[26]。

1.3.2 聚 类分析

对75 份蝴蝶豆属资源的38 个植物学性状指标进行标准化处理，使用SPSS 软件进行系统聚类分析。采用欧式距离作为各指标之间的距离度量，对标准化后的数据进行聚类，以研究各物种之间的相关性。欧式距离越大，表示两者之间亲缘关系越远，遗传差异越大。

2 结果与分析

2.1 蝴蝶豆种质资源植物学性状频率分布

蝴蝶豆资源31 个质量性状中，叶色、旗瓣颜色、荚果颜色的遗传多样性指数均大于1；其中，荚果颜色多样性指数最高(1.46)，生活型、茎生长习性、叶的类型、中央小叶脉序、叶缘、叶柄毛况、托叶质地、花序类型、雄蕊类型、雌蕊类型、荚果毛况、裂荚性12 个质量性状多样性指数均为0 (表3)。在蝴蝶豆荚果颜色形状中，红褐色分布频率最高，达44.0%，深绿色分布频率最低，为1.3%；叶色性状中，绿色叶分布频率最高，为49.3%，浅绿色叶分布频率最低，为17.3%；旗瓣颜色中，白色分布频率最大，为38.7%，浅蓝分布频率最小，为1.3%。可见，蝴蝶豆果荚以红褐为主，叶色以绿色为主，旗瓣颜色以白色为主。

表3 蝴蝶豆种质资源质量性状频率分布Table 3 Frequency distribution of quality traits

2.2 蝴蝶豆种质植物学性状的变异性

75 份蝴蝶豆属资源的38 个植物学性状结果显示，旗瓣颜色的植物学性状变异系数最大达到79.68%，其次是茎毛况和叶背面毛况，它们的变异系数分别为46.03%和42.18% (表4)。另外，关于生活型、茎生长习性、叶类型、中央小叶脉序、叶缘、叶柄毛况、花序类型、雄蕊类型、雌蕊类型、荚果毛况、裂荚性这11 个质量性状，没有观察到任何变异情况，这说明蝴蝶豆植物学性状稳定，而且具有丰富的遗传多样性。所测定指标中，叶片相关指标有19 个，变异系数平均值为18.5%；茎相关指标有5 个，变异系数平均值为26%；花果相关指标12 个，变异系数平均值为16%。多重比较发现，蝴蝶豆的叶、茎、花、荚果、生活型的变异系数平均值没有显著差异(表5)，这说明蝴蝶豆的遗传多样性来源分布比较均匀。所测38 个指标中，旗瓣颜色、茎毛况、叶背面毛况、叶片腹毛况变异系数最大。说明，蝴蝶豆遗传多样性来源分布均匀，其旗瓣颜色、茎毛况、叶背面毛况和叶片腹毛况在其遗传多样性中起关键作用。

表4 蝴蝶豆属供试材料各性状的变异情况Table 4 Variation in morphological traits of the accessions

表5 蝴蝶豆属茎、叶、花、荚果的多重比较Table 5 LSD multiple comparison of stems, leaves, flowers, and pods of Phaseolus

2.3 蝴蝶豆种质植物学性状间的相关性

27 个标准差不为0 的蝴蝶豆植物学性状指标的相关性分析结果显示，个别组性状间存在显著(P<0.05)、极显著相关关系(P< 0.01)，其中有8 个性状与自然高度呈显著、极显著关系；说明，蝴蝶豆各性状并非独立存在，且与自然高度相关紧密(表6)。茎毛况与茎毛类型、叶背面毛况、叶宽度3 个性状呈极显著相关，相关系数分别为0.782、0.381、0.298；与小叶长、小叶宽、叶长度3 个性状呈显著相关；说明茎毛况和叶长、宽以及植株生长自然高度存在关联，叶片越长越宽且自然高度越高茎毛越密。叶色、小叶长、小叶宽、叶长、叶宽这5 个性状都与自然高度呈显著关系，说明自然高度是决定叶色、小叶长、小叶宽、叶长、叶宽的主要因素。托叶与托叶形状、托叶质地呈极显著相关关系，相关系数为0.432、0.941，说明同一物质结构的各项性状间相关性较高。

表6 蝴蝶豆属植物学性状间的相关系数Table 6 Correlation coefficients among botanical characters

2.4 蝴蝶豆种质资源植物学性状的主成分分析

对27 个标准差不为0 的形状指标标准化后进行主成分分析(表7)。使用主成分分析，根据各主成分的特征值和贡献率，提取成分。在此过程中，特征值大于1 的主成分共有10 个，累计方差贡献率74.493%。这些主成分可以代表所有指标的大部分信息，因此可以作为蝴蝶豆种质初步评价筛选的综合指标。并通过载荷矩阵(表8)可知影响第1 主成分(贡献率18.145%)的主要性状为叶宽度和小叶长，表明它主要反映叶片大小；影响第2 主成分(贡献率11.391%)为托叶形状和叶片毛被类型，说明第2 主成分主要反映叶片被毛情况；第3 主成分反映了托叶特性；第4 主成分和第5 主成分反映了荚果特性；第6 主成分和第7 主成分主要影响因子为茎颜色和茎的形状，反映了茎的情况；第8 主成分的贡献率为1.181%，影响性状为旗瓣形状，反映旗瓣情况；茎形状为第9 主成分的影响因子，叶色为第10 主成分的影响因子。由此得出影响变异的主要性状指标为叶宽度、托叶形状、托叶、荚果长度、茎颜色、旗瓣形状、荚果宽度、茎形状、叶色。

表7 各指标主成分的方差贡献率Table 7 Variance contribution rate of principal components of each index

表8 各指标主成分载荷矩阵Table 8 Principal component load matrix of each index

2.5 蝴蝶豆种质资源植物学性状的系统聚类分析与综合排名

对于75 份蝴蝶豆种质资源材料的27 个标准差不为0 的性状指标进行标准化后，进行了系统聚类分析，并得到聚类图(图1)。聚类分析结果并表明，所有材料的遗传距离范围为2.611～13.626，说明这些蝴蝶豆属种质资源具有较为丰富的遗传多样性。其中，3 号和68 号的欧式距离最小，二者归为一类；23 号和26 号欧式距离最大，二者分为两类。

图1 蝴蝶豆属植物学性状聚类分析图Figure 1 Cluster analysis of botanical characters of genus Phaseolus

当欧式距离为10 时，可将75 份蝴蝶豆种质资源分为11 大类。其中，第1 大类包括3、68、42、73、48、51、43、63、29、47、17、10、30、15、37、75、21、58、57、19、35、56、46、6、55、8、12、40、31、4、61、1、50、28、39、20、71、59、62、66、24、38、69、34、13，共45 份材料，主要以海南本地收集的野生材料为主，少数为国外引进材料，这些材料茎毛多、叶片具密毛、叶片小、自然高度低等特点；第2 大类有44、54、74、22、60，共5 材料表现；第3 大类有5、64；第4 大类有49、70；第5 大类有2、18、11、53、25、7；第6 大类有27、52、9、33；第7 大类有14、32、72、41、65、45；剩余材料16、67、26 分别单独聚为1 类；第11 大类有23、36。第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 大类这些材料茎毛无或少、叶片无毛、叶片大、自然高度高等特点。说明，国外引进材料与海南野生收集的多数材料亲缘关系较近，且国内收集的野生资源跨类较多、种间变异较大。通过综合D 值对所有材料进行排名(表9)，最终筛选出3 份材料，编号45、14、32 材料整体表现最优。

表9 综合排名Table 9 Comprehensive ranking

3 讨论

目前，对于蝴蝶豆的研究主要集中在施肥、产量、耐阴性、抗旱性及发芽方法等方面[27-29]。在国外，研究人员主要关注于蝴蝶豆的两个方面，即其作为饲草料的利用以及其在固氮方面的作用[30]。在有关蝴蝶豆属种质资源的形态学标记方面相关内容尚未研究，而我国南方热区种植的优异豆科牧草品种较少，可以通过培育优异的豆科藤本牧草品种，满足畜牧业生产的迫切需要。

此次遗传多样性研究结果表明，叶色、旗瓣颜色、荚果颜色的遗传多样性指数均大于1，且旗瓣颜色变异系数最大，说明同属植物不同种质之间的遗传多样性由叶与旗瓣控制，旗瓣颜色在一定程度上是新品种选育中最直观的观测指标，这与严琳玲等[22]和许文婷等[31]研究结果一致；与赵喜萍[32]认为花的变异性比其他性状更为丰富相一致。

研究表明，牧草品质有很多因素影响。植物的生长特性，如高度、叶形和叶片大小，与牧草的产量密切相关。此外，生活型、茎生长习性、叶片大小等指标也会对牧草的产量产生影响[33]；而叶尖的存在与否、荚果的特征、茎和叶片的毛发等特征也会对牧草的饲用品质产生影响[34]。本研究通过相关性分析表明有8 个性状与自然高度呈显著、极显著关系，说明蝴蝶豆各性状并非独立存在，而是有相关性的，且大多数都与自然高度相关，这与王鹤琪[35]对松嫩草地30 种植物形态性状、产量及品质相互关系研究结果一致，自然高度对单株产量(叶干重、茎干重)及品质(粗蛋白)具有一定的指示作用；与马崇坚等[36]认为皇竹草(Pennisetum sinese)植株株高、分蘖数、有效茎数和产量相互间关系极显著正相关结果一致；与耿小丽等[37]认为叶片宽度与株高有密切关系的结论一致。本研究主成分分析提取出10 个主成分。这10 个主成分反映了蝴蝶豆茎、叶、花、果的整体情况，而叶宽度、托叶形状、托叶、荚果长度、茎颜色、旗瓣形状、荚果宽度、茎形状、叶色在主成分元件中数值最大说明这些形状与主成分关系密切，是影响变异的主要形状指标，这与变异分析结果相符。因此，通过株高、叶形和荚果的大小、中央小叶指标来挑选高产候选材料；通过叶尖有无或整株被毛状况来挑选适口性好[38]的材料，从而获得最佳育种候选材料。

通过将所测指标进行聚类分析，在欧式距离10 处将75 份蝴蝶豆分为11 大类，说明蝴蝶豆种内变异较大。聚类分析结果第7 大类包括6 份，并通过综合D 值，对所有标准差不为0 的蝴蝶豆植物学性状指标权重进行排序[39]，D 值越小说明表型越好，筛选出050319012 距瓣豆、CIAT25118 草地蝴蝶豆、060301016 蝴蝶豆共3 份叶片柔毛少、小叶宽度大、可作为蝴蝶豆优异的候选材料。

表型变异只能通过直接观测表型的变化得到想要的优异材料，而于分子标记可以直观、快速、经济地判断种质的好坏，分子标记遗传变异是在表型变异的基础上进行的，目前的研究尚未结合分子标记等方法对资源进行鉴定。因此，下一步应结合分子水平的基因鉴定方法对初步筛选出的优良资源进行进一步鉴定评价，以便更好地开发利用蝴蝶豆资源。

4 结论

本研究详细研究了蝴蝶豆属植物资源之间的形态学遗传多样性特征，确定了旗瓣颜色、茎毛情况和叶背面毛况的变异系数是区分蝴蝶豆属种质资源的重要指标。通过聚类分析并结合所测形态学指标，筛选出050319012 距瓣豆、CIAT25118 草地蝴蝶豆、060301016 蝴蝶豆叶片柔毛少，小叶宽度大，高产量等特点的蝴蝶豆属材料，为蝴蝶豆属种质资源后续植物学性状分子标记提供育种候选材料，为评价蝴蝶豆营养价值提供参考。