钾肥对苜蓿低温胁迫下抗氧化酶活性的影响

张庆昕， 张玉霞*， 孙明雪， 夏全超， 王显国， 刘庭玉， 杜晓艳

（1.内蒙古民族大学农学院，内蒙古自治区饲用作物工程技术研究中心，内蒙古 通辽 028041；2.中国农业大学草业科学与技术学院，北京 100193）

苜蓿(Medicago sativa)作为多年生豆科草本植物[1]，具有营养价值高、适口性好、适应性强等优点[2]。虽然苜蓿的抗逆性较强，但是我国北部高寒地区冬季寒冷少雪，冬春两季常会因寒流侵袭发生倒春寒、极端低温等现象，这已经成为限制苜蓿可持续生产的重要因素[3]。

低温胁迫下，植物细胞膜质过氧化过程加剧，膜系统的氧化性损伤严重，会生成氧化分解产物丙二醛（malondialdehyde，MDA）[4]，对生物膜造成伤害，此时植物会通过超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）等抗氧化酶清除一定范围内在低温胁迫刺激下植物代谢过程中产生的活性氧[5]，维持细胞膜系统的稳定性。因此低温胁迫下的MDA 含量可以衡量苜蓿的抗寒性[6]，抗氧化酶活性强弱是评价苜蓿抗氧化能力的生理指标[7-8]。

钾是植物生长必需的三大元素之一，素有“抗逆元素”之称，是植物细胞内含量最高的阳离子，能高速通过生物膜[9-11]；钾元素还是大多数酶的关键辅助因子，其中抗氧化酶系统中酶活性的启动就需要钾元素的参与[12-14]。农业生产中的钾肥种类有KCl、K2SO4和KH2PO4等[15-16]，已有的研究主要是围绕苜蓿对低温胁迫的响应及单一种类钾肥对其他作物的影响[17-20]，关于钾肥种类和用量对苜蓿抗氧化生理特性的影响是否存在差异的研究较少。因此，本研究对不同钾肥种类和用量对苜蓿根颈在低温胁迫下生理响应进行了系统的分析，阐释不同钾肥处理的苜蓿根颈在低温胁迫下膜质氧化程度和抗氧化特性，提出种植苜蓿最适宜施用的钾肥种类及用量，旨在为科尔沁沙地苜蓿抗寒高产栽培中钾肥的高效管理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于内蒙古通辽市开鲁县东风镇林辉草业公司基地（43°61′N，121°30′E），该地区属于温带大陆性半干旱气候，四季分明，降水主要集中在夏季，冬季干旱少雪，≥10 ℃年积温为3 000～3 200 ℃，年平均气温5.6 ℃，无霜期138～153 d，年平均降水量375 mm，年平均风速3.0～4.4 m·s-1，土壤有机质含量6.41 g·kg-1，速效磷含量3.62 mg·kg-1，速效钾含量77.85 mg·kg-1，碱解氮含量35.84 mg·kg-1，全氮含量44.03 g·kg-1。

1.2 试验材料

供试紫花苜蓿品种(M. sativa‘Gibraltar’)为‘北极熊’，由北京百思特有限公司提供。该品种的秋眠级为2.0级，幼苗强壮、根系发达，是抗寒性能非常突出的苜蓿品种。供试肥料KCl（K2O≥60%）、K2SO4（K2O≥52%）和KH2PO4（K2O≥34%）分别来源于中化化肥有限公司、国投新疆罗布泊钾盐有限责任公司和四川省绵竹市汉旺无机盐化工有限公司。

1.3 试验设计

试验地土壤类型为沙壤土，该土壤类型保水保肥能力较差，透气性好，土壤持水量小，土温变幅较大，易耕作。试验采用随机区组设计，播种前一次性施入过磷酸钙(P2O5含量为44%)200 kg·hm-2作基肥。2020年7月1日播种，播种量为22.5 kg·hm-2。分别施用KCl、K2SO4和KH2PO43种钾肥，单施的施用量分别为100、200和300 kg K2O·hm-2（分别用K1、K2和K3表示），并设置不施钾肥（0 kg K2O·hm-2）作为对照(CK)，每个处理设置3 次重复，共30 个小区，小区面积为3 m×5 m=15 m2，行距为20 cm，供试钾肥均作为基肥于播种前一次性施入，施肥方式为撒施。试验田灌水使用指针式喷灌，期间进行正常的田间管理。

于封冻前（11 月15 日）挖取长势一致的苜蓿根系（越冬器官），带回室内进行低温处理。参照朱爱民等[21]的低温处理方法，每个小区取60 株长势均匀一致的苜蓿根颈，用蒸馏水洗净擦干后平均分成4 份，其中1 份放入4 ℃冰箱中储存（低温冷藏），将另外3份苜蓿根系整齐的排放在20 cm×30 cm 的脱脂纯棉布上包裹好，然后用适量蒸馏水将卷好的脱脂纯棉布均匀喷洒，使棉布保持湿润，最后用30 cm×30 cm的锡箔纸包裹好，放入可程式恒温恒湿试验箱[6-8,13-14,21]分别进行-10、-20、-30 ℃低温处理（低温冷冻）。可程式恒温恒湿试验箱设置为：以4 ℃为起点，先以4 ℃·h-1的速率降温，达到目标温度后保持6 h，然后以4 ℃·h-1的速度升温至4 ℃。低温冷冻材料取出后在4 ℃下放置12 h，与冷藏处理材料一同取苜蓿根颈下1 cm 长度，切为薄片后测定根颈MDA 含量及CAT、POD 和SOD活性。

1.4 测定指标及方法

丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[22]测定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑法[14]测定，过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法[22]测定，过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法[13]测定。

1.5 统计分析方法

试验数据用Microsoft Excel 软件处理、制作表格，用DPS 7.0软件进行方差显著性分析及相关性分析，采用Duncan 检验方法新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 钾肥对低温胁迫下苜蓿根颈丙二醛含量的影响

如表1所示，4、-20和-30 ℃低温胁迫处理下，KCl处理的苜蓿根颈丙二醛（MDA）含量在K1处理下达到最小值，分别较CK 显著（P<0.05）降低了13.56%、20.11%和17.01%。4、-20 和-30 ℃低温胁迫处理下，K2SO4处理的苜蓿根颈MDA 含量在K2处理下达到最小值，分别较CK显著（P<0.05）降低了18.64%、41.85%和44.44%。4、-10、-20 和-30 ℃低温胁迫处理下，KH2PO4处理的苜蓿根颈MDA 含量均在K2处理下达到最小值，且与CK 差异显著（4 ℃处理除外），在-10、-20 和-30 ℃下分别较CK 显著（P<0.05）降低了34.62%、28.80%和39.24%。3 种钾肥处理下，在4、-10、-20 和-30 ℃低温胁迫下K2SO4处理的苜蓿根颈MDA含量均最小（-30 ℃的K1处理除外）。以上说明K2SO4种类钾肥更利于缓解苜蓿根颈细胞膜质氧化过程，且以K2处理（200 kg·hm-2K2O施用量）为宜。

表1 不同钾肥种类和用量下低温胁迫处理苜蓿根颈丙二醛的含量Table 1 MDA content in alfalfa root crowns with different potassium fertilizer types and dosages under low temperature stress（nmol·g-1）

2.2 钾肥对低温胁迫下苜蓿根颈超氧化物歧化酶活性的影响

如表2 所示，4、-10、-20 和-30 ℃低温胁迫处理下，KCl 处理的苜蓿根颈超氧化物歧化酶（SOD）活性在不同钾肥施用量处理下均显著（P<0.05）高于CK（-10 和-30 ℃处理的K3处理除外），且均在K1处理下达到最大值，分别较CK 增长了23.50%、21.54%、30.13%和35.00%；K2SO4处理的苜蓿根颈SOD 活性在不同钾肥施用量处理下均显著高于CK（P<0.05），且在K2处理下达到最大值，分别较CK 增长了36.06%、30.02%、63.37%和52.06%；KH2PO4处理的苜蓿根颈SOD活性在不同钾肥施用量处理下均显著（P<0.05）高于CK（-10 ℃的K3处理除外），且均在K2处理下达到最大值，分别较CK 增长了28.91%、24.28%、36.12%和47.69%。3 种钾肥处理下，在4、-10、-20和-30 ℃低温胁迫时均以K2SO4处理的苜蓿根颈SOD 活性最高（4 ℃的K1处理除外），其中在K2和K3处理下与KCl 处理之间差异显著（P<0.05）。说明K2SO4种类钾肥最有利于增强苜蓿根颈的SOD活性，且K2处理（200 kg K2O·hm-2）效果最佳。

表2 不同钾肥种类和用量下低温胁迫处理苜蓿根颈超氧化物歧化酶的活性Table 2 SOD activity in alfalfa root crowns with different potassium fertilizer types and dosages under low temperature stress（U·g-1 FW）

2.3 钾肥对低温胁迫下苜蓿根颈过氧化氢酶活性的影响

如表3所示，4、-20和-30 ℃低温胁迫处理下，KCl 处理的苜蓿根颈过氧化氢酶（CAT）活性均在K1处理下达到最大值，分别较CK 显著(P<0.05)增长25.66%、31.26%和17.19%。4、-10、-20和-30 ℃低温胁迫下，K2SO4处理的苜蓿根颈CAT活性在不同钾肥施用量下均显著高于CK（P<0.05），且均在K2处理下达到最大值，分别较CK 增长63.36%、37.37%、75.83%和38.10%。4、-10 和-20 ℃低温胁迫下，KH2PO4处理的苜蓿根颈CAT 活性在不同钾肥施用量下均显著高于CK（P<0.05），且均在K2处理下达到最大值，分别较CK 增长46.12%、15.20%和44.57%。3种钾肥处理下，在4、-10、-20和-30 ℃低温胁迫时均以K2SO4处理的苜蓿根颈CAT 活性最高，且在不同钾肥施用量下均与KCl 处理的CAT 活性差异显著（P<0.05）（-20 ℃的K1处理除外）。说明K2SO4种类钾肥K2处理（200 kg K2O·hm-2）最有利于增强CAT 活性，清除H2O-2，减轻有毒害作用的物质对细胞的伤害。

表3 不同钾肥种类和用量下低温胁迫处理苜蓿根颈过氧化氢酶的活性Table 3 CAT activity in alfalfa root crowns with different potassium fertilizer types and dosages under low temperature stress（U·g-1·min-1）

2.4 钾肥对低温胁迫下苜蓿根颈过氧化物酶活性的影响

如表4所示，4、-10和-20 ℃低温胁迫处理下，KCl 处理的苜蓿根颈过氧化物酶（CAT）活性均在K2处理下达到最大值，分别较CK 显著（P<0.05）增长26.70%、27.36%和18.89%。4、-10、-20和-30 ℃低温胁迫处理下，K2SO4处理的苜蓿根颈CAT活性在不同钾肥施用量下均显著高于CK（P<0.05），且均在K2处理下达到最大值，分别较CK 增长58.59%、59.10%、44.13%和16.39%。4、-10、-20和-30 ℃低温胁迫处理下，KH2PO4处理的苜蓿根颈CAT活性在不同钾肥施用量下均显著（P<0.05）高于CK（-30 ℃的K1处理除外），且均在K2处理下达到最大值，分别较CK 增长45.86%、48.47%、23.35%和10.06%。3种钾肥处理下，在4、-10、-20和-30 ℃低温胁迫时均以K2SO4处理的苜蓿根颈CAT 活性最高（4 ℃的K1处理除外），且在不同钾肥施用量下与KCl 处理的CAT 活性差异显著（-30 ℃的K1处理除外），在-20 和-30 ℃下与KH2PO4处理的CAT 活性差异显著（P<0.05）。说明K2SO4种类钾肥K2处理下（200 kg·hm-2K2O）增强POD活性的效果最明显。

表4 不同钾肥种类和用量下低温胁迫处理苜蓿根颈过氧化物酶的活性Table 4 POD activity of alfalfa root crowns with different potassium fertilizer types and dosages under low temperature stress（U·g-1·min-1）

2.5 根颈中丙二醛与抗氧化酶活性的相关性分析

如表5 所示，4、-10、-20 和-30 ℃低温胁迫处理下的苜蓿根颈CAT 活性均与POD 活性呈极显著正相关（P<0.01）；-10、-20 和-30 ℃低温胁迫处理下的苜蓿根颈SOD活性与MDA含量呈极显著负相关（P<0.01），与CAT 活性呈极显著正相关（P<0.01）；4、-10和-20 ℃低温胁迫处理下的苜蓿根颈SOD 活性与POD 活性呈极显著正相关（P<0.01）；4 ℃低温胁迫处理下的MDA 含量与SOD 活性呈显著负相关（P<0.05），4 和-30 ℃低温胁迫处理下的MDA 含量与CAT 活性呈显著负相关（P<0.05）；-30 ℃低温胁迫处理下的POD 活性与MDA 含量呈显著负相关（P<0.05），与SOD 活性呈显著正相关（P<0.05）；-10 和-20 ℃低温胁迫处理下的MDA 含量与POD 活性均呈极显著负相关（P<0.01），以上说明苜蓿根颈中抗氧化酶（CAT、POD 和SOD）活性越高，MDA 含量就越低，苜蓿根颈细胞中清除毒害物质的能力就越强，膜质过氧化程度就越轻，苜蓿的抗寒能力更强。

表5 苜蓿根颈丙二醛与抗氧化酶活性的相关性分析Table 5 Correlation analysis of alfalfa root crown malondialdehyde and antioxidant enzyme activity

3 讨论

植物受到低温胁迫时，植物细胞膜的膜质会发生过氧化，导致细胞膜系统的氧化性损伤[23]，MDA 含量的多少可反映植物细胞受伤害的程度[24-25]。本研究表明，随着低温胁迫温度的降低，苜蓿根颈MDA 含量持续增加，说明低温胁迫会破坏细胞膜结构，温度越低，细胞膜质的过氧化过程越剧烈，积累的过氧化产物就越多。李双铭等[26]研究表明，随着温度的降低，结缕草叶片中的MDA 含量升高；孙予璐等[27]研究也发现，低温胁迫下4 个供试品种紫花苜蓿丙二醛含量较对照组有所提高，且随着温度降低，丙二醛含量呈上升趋势，均与本研究结果一致。本研究还表明，KCl、K2SO4和KH2PO43 种钾肥对苜蓿根颈的MDA 含量均有显著影响，并且随着钾肥施用量的增加，MDA 含量表现为先降低后升高的趋势，说明适量的钾肥有利于降低苜蓿根颈的MDA 含量，而过量的钾肥会对苜蓿细胞产生胁迫，对细胞膜质产生进一步的伤害，进而导致MDA 含量增长[28]。本研究中，K2SO4处理的苜蓿根颈MDA 含量在不同低温胁迫处理下明显小于KCl 和KH2PO4处理，可能的原因是K2SO4中有，其中S元素也有影响植物细胞膜结构的作用，且周杰[29]的研究表明，施硫能降低小麦旗叶MDA含量，因此与KCl和KH2PO4处理相比，K2SO4处理更有利于缓解细胞膜质过氧化程度，保护细胞膜结构。

当植物受到低温胁迫时，会产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 能参与各种新陈代谢，是调控细胞生长及死亡的第二信使，在正常的生长环境中，ROS 在植物体内应处于动态平衡的状态；低温胁迫下，ROS的大量产生会造成DNA 受损、蛋白质失活、细胞膜质过氧化甚至细胞功能紊乱、死亡等一系列生化反应[30]，进而激活由酶抗氧化防御系统和非酶抗氧化防御系统组成的ROS 清除系统，其中酶抗氧化防御系统包括SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶[31]。SOD 作为清除ROS 的第一道防线，能催化超氧阴离子（O2-）歧化为过氧化氢（H2O2），其活性的强弱直接影响了植物的抗寒性；POD 具有防止羟基在植物体内合成，催化各种细胞壁结构合成及降解H2O2的作用；CAT 则是以铁卟啉为辅基，既能催化H2O2分解，减轻H2O2对细胞的毒害作用，又能协助SOD清除ROS[32-33]。本研究表明，在-20 ℃低温处理下3种抗氧化酶活性最强，但当低温胁迫温度低于-20 ℃，已超过抗氧化酶系统可清除的阈值，系统遭到破坏[34]，即CAT、POD 和SOD 活性降低。李波等[35]研究表明，随着低温胁迫温度的降低，‘龙牧807’苜蓿幼苗POD、SOD 活性呈先升后降的变化趋势；于丹等[36]的研究也表明杏树雌蕊的CAT 和POD 活性随温度的降低呈先上升后下降的趋势，均与本研究结果一致。本研究中，KCl、K2SO4和KH2PO4均对苜蓿根颈的CAT、POD 和SOD 活性有显著影响，并且随着钾肥施用量的增加表现为先上升后下降的变化趋势，且在不同低温胁迫处理下的CAT、POD 和SOD 活性在不同钾肥施用量下均明显高于CK（POD 活性在-30 ℃下除外），说明施钾有利于提高苜蓿根颈中的CAT、POD 和SOD活性，与沈超[37]、罗帅[38]的研究结果一致。并且本研究中，K2SO4处理较KCl 和KH2PO4处理的苜蓿根颈中抗氧化酶活性更强，可能是因为K2SO4中的S 作为酶化反应活性中心的重要元素[39]，对抗氧化酶活性的变化也有重要作用，且王媛媛等[40]的研究也表明，施S 明显提高了花生叶片中CAT、POD 和SOD 活性。此外，本试验中K2SO4处理的苜蓿根颈在200 kg K2O·hm-2施用量处理下CAT、POD 和SOD 活性显著高于CK 及其他钾肥施用量（P<0.05），说明施用K2SO4增强苜蓿根颈抗氧化酶活性的效果最明显，并且以200 kg K2O·hm-2施用量为宜。