茵陈-大黄不同配比对绿原酸和蒽醌类成分的影响

■ 张 伟 段佳燚 马铭环 郭振环 马 霞

（1.青岛农业大学海都学院，山东莱阳 265200；2.山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061；3.青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109；4.河南牧业经济学院动物医药学院，河南郑州 450046）

茵陈为菊科植物滨蒿或茵陈蒿的干燥地上部分[1]，性味苦、辛，微寒；归脾、胃、肝、胆经；主治清湿热，利胆退黄。大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根及根茎[1]，性味苦，寒；归胃、大肠、肝、脾经；主治清热泻下，利肠通便，凉血止血，解毒活血，逐瘀通经。“茵陈-大黄”作为利湿退黄的经典药对，最早出自茵陈蒿汤，两药合用，利湿与泄热同行，二便通利，湿热得行，瘀热得下，黄疸自退[2-3]。茵陈和大黄作为药对，在许多古方和中成药制剂中被使用，例如茵陈蒿汤、茵陈胆道汤、黄疸茵陈颗粒、柴胡茵陈汤、茵陈四苓颗粒等，且其不同的配伍规律展现出不同的药效[4-5]。

绿原酸类物质分子结构复杂，合成成本高昂。在自然界中绿原酸却来源广泛，主要被发现存在于高等双子叶植物和蕨类植物中，例如菊科蒿属植物（如向日葵）、忍冬科忍冬属（如金银花）、杜仲科杜仲属（如杜仲）。研究发现，不同植物所含绿原酸种类不同，而在茵陈中含量较高的则为1,5-二咖啡酰奎宁酸，随后才是绿原酸和异绿原酸A。其具有抗氧化活性、抗菌抗病、进行免疫调节以及调节糖脂代谢的功能[6]。

茵陈含有多种化学成分，主要类型为黄酮、香豆素、有机酸、稀炔、色原酸、醛酮、胆碱等[7]。研究发现，茵陈具有显著的保肝利胆作用、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抑菌和抗病毒等作用。相关药理机制为茵陈及其单体化合物可调控PI3KIAktNF-κB等信号通路，影响caspase-1、Smad3等蛋白和iNOS、COX-2、TNF-α等细胞因子的表达，发挥其保肝利胆、退黄利湿、抗炎、抗病毒、抗肿瘤和神经系统等药理活性[8]。大黄含有蒽醌、鞣质类、有机酸、苷类化合物和挥发油等化学物质。在临床用药过程中，大黄发挥主要药理作用的活性成分为蒽醌，包括游离及结合型大黄素、大黄酸、大黄素甲醚等[9-10]。大黄酸可通过调节肠道菌群，间接改变肠道嘌呤代谢，从而减轻结肠炎。大黄提取液干预脑出血模型大鼠后，可以显著上调IL-4、IL-10 表达，下调TNF-α、IL-6、IFN-γ表达，发挥抗炎作用[11]。本试验探讨茵陈-大黄不同配比对绿原酸和蒽醌类成分的影响，筛选出二者最佳配伍比例。旨在为开发新药提供理论依据。

1 试验材料及方法

1.1 试验材料

大黄（亳州药材市场）、茵陈（亳州药材市场）、绿原酸（长沙上禾生物科技有限公司，CAS 号：327-97-9，纯度：HPLC＞98%）、大黄酸（长沙上禾生物科技有限公司，CAS 号：478-43-3，纯度：HPLC＞98%）、芦荟大黄酸（上海诗丹德标准技术服务有限公司，CAS 号：481-72-1，纯度：HPLC＞98%）、大黄素甲醚（长沙上禾生物科技有限公司，CAS 号：521-61-9，纯度：HPLC＞98%），色谱级甲醇、色谱级乙腈（天津市四友精细化学品有限公司）。

高效液相色谱仪（Agilent Technologies）、高速离心机（赛默飞世尔科技有限公司）、超声波清洗机（郑州生元仪器有限公司）、色谱柱（常熟市双杰机器测试仪器）、循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 茵陈与大黄配伍的提取方法

1.2.1.1 水煎法

大黄后下：按茵陈-大黄质量比1∶1、1∶2、2∶1 称取药材，分别加入清水适量，浸泡30 min，茵陈先煎煮20 min，再加入大黄煎煮15 min，二煎后浓缩至溶液中药材含量约为1 g/mL，浓缩药液放入-20 ℃冷冻保存。

茵陈-大黄同时下：混合浸泡茵陈与大黄30 min，煎煮40 min，过滤，滤液备用；滤渣中加入适量清水，煎煮20 min，过滤，合并两次滤液，浓缩至溶液中药材含量约为1 g/mL浓缩药液放入-20 ℃冷冻保存。

茵陈、大黄单味药的煎煮方法同茵陈-大黄同时下的煎煮方法。

1.2.1.2水煎醇沉法

取上述水煎法中大黄后下，茵陈、大黄同时下的全部水煮液各一半，分成两份置于烧杯中，加入95%乙醇溶液适量，使溶液中乙醇最终浓度一份为70%，一份为80%；静置48 h，抽滤，回收乙醇，沉淀放入-20 ℃冷冻保存。

1.2.2 茵陈与大黄配伍中绿原酸与蒽醌类成分的含量测定

1.2.2.1 绿原酸含量的测定

参照中华人民共和国兽药典二部茵陈项下含量测定方法[12]。

① 色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相：乙腈∶0.1%磷酸溶液=20∶80；检测波长：327 nm；柱温：30 ℃；流速：1.00 mL/min；

② 对照品溶液的制备：称取绿原酸对照品适量，50%甲醇制成每毫升含绿原酸70 μg的溶液。

③ 供试品溶液的制备：将原药液按1∶5加入50%甲醇，超声处理30 min，3 000 r/min 离心10 min；吸取1 mL 上清液置于5 mL 容量瓶中，50%甲醇定容，摇匀，过滤，即得供试品溶液。

④含量测定：将对照品及供试品溶液注入液相色谱仪检测，根据对照品峰面积和浓度计算含量。

1.2.2.2 蒽醌类成分的含量测定

参照中华人民共和国兽药典中大黄项下含量测定方法[12]。

① 色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相：甲醇∶0.1%磷酸溶液=85∶15；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；流速：1.00 mL/min。

② 对照品溶液的制备：称量大黄素甲醚、大黄酸及芦荟大黄素对照品加入50%甲醇充分溶解，制备成混合对照品溶液(含大黄酸、芦荟大黄素32 μg/mL，大黄素甲醚16 μg/mL)。

③ 含量测定：供试品溶液制备同绿原酸含量测定样品处理方法，将样品注入液相色谱仪，根据样品所测峰面积与对照品峰面积计算各成分含量。

1.2.3 统计与分析

所得试验数据均使用GraphPad Prism 7 软件进行统计学分析处理。**表示差异显著（P＜0.05），ns表示差异不显著（P＞0.05）。

2 结果与分析

2.1 绿原酸成分含量测定结果

图1所示，水煎法提取液中，茵陈-大黄1∶1、1∶2、2∶1 三种不同配伍比例按照大黄同时下以及大黄后下中测定的绿原酸含量均高于茵陈单味药中折算后绿原酸含量的理论值，且茵陈-大黄1∶1 提取出绿原酸的含量相较于其他组显著升高（P＜0.05）。

图1 水煎原药液中绿原酸含量的测定结果

如图2（A）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为70%时的上清液中，茵陈-大黄1∶1、茵陈-大黄1∶2后下两种配伍测定的绿原酸含量高于茵陈单味药折算后绿原酸的含量的理论值；其余配伍所测定的绿原酸含量则均低于茵陈单味药折算后绿原酸的含量的理论值，且茵陈-大黄1∶1 提取的绿原酸含量显著高于茵陈-大黄2∶1 以及茵陈-大黄1∶1 后下、1∶2 后下、2∶1 后下（P＜0.05）。如图2（B）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为70%时的沉淀中，茵陈-大黄1∶1、1∶2、2∶1 三种不同配伍比例按照大黄同时下以及大黄后下测定的绿原酸含量均高于茵陈单味药折算后绿原酸含量的理论值，且茵陈-大黄1∶1 提取的绿原酸含量显著高于其余组（P＜0.05）。如图2（C）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为80%时的上清液中，茵陈-大黄1∶1 后下配伍测定的绿原酸含量低于茵陈单味药折算后绿原酸的含量的理论值；其余配伍所测定的绿原酸含量则均高于茵陈单味药折算后绿原酸的含量的理论值，且茵陈-大黄1∶1提取的绿原酸含量显著高于茵陈-大黄2∶1以及茵陈-大黄1∶1 后下、1∶2 后下、2∶1 后下（P＜0.05）。如图2（D）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为80%时的沉淀中，茵陈-大黄1∶2、2∶1后下两种配伍测定的绿原酸含量低于茵陈单味药折算后的绿原酸含量的理论值；其余配伍所测定的绿原酸含量均高于茵陈单味药折算后绿原酸的含量的理论值，且茵陈-大黄1∶1提取的绿原酸含量显著高于茵陈-大黄1∶2 以及茵陈-大黄1∶1后下、1∶2后下、2∶1后下（P＜0.05）。

图2 绿原酸含量的测定结果

2.2 蒽醌类成分含量测定结果

2.2.1 水煎原药液中蒽醌类成分含量测定

如图3（A）所示：水煎法提取液中，茵陈-大黄1∶1 后下和1∶2 后下两种配伍测定的大黄酸的含量低于大黄单味药折算后大黄酸的含量的理论值；其余4 种配伍中所测定的大黄酸的含量均高于大黄单味药折算后大黄酸的理论值，且茵陈-大黄1∶2 提取出大黄酸含量显著高于其余组（P＜0.05）。图3（B）所示：水煎法提取液中，茵陈-大黄1∶1、1∶2、2∶1 三种不同配伍比例按照大黄同时下以及大黄后下中测定的芦荟大黄素含量均高于茵陈单味药中折算后芦荟大黄素含量的理论值，且茵陈-大黄1∶1 后下、1∶2 后下以及茵陈-大黄1∶2 提取出芦荟大黄素含量显著高于茵陈-大黄1∶1（P＜0.05）。图3（C）所示：水煎法提取液中，茵陈-大黄1∶1 后下、1∶2 后下两种配伍测定的总蒽醌成分含量低于大黄折算后总蒽醌成分含量的理论值；而其余4 种配伍测定的总蒽醌成分含量均高于大黄折算后总蒽醌含量的理论值，且茵陈-大黄1∶2提取出总蒽醌含量显著高于除菌陈-大黄1∶3之外的其余组（P＜0.05）。

图3 水煎原药液中蒽醌类成分含量测定结果

2.2.2 大黄酸结果测定

如图4（A）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为70%时的上清液中，茵陈-大黄1∶1、1∶2、2∶1 三种不同配伍比例按照大黄同时下以及大黄后下测定的大黄酸含量均高于大黄单味药折算后大黄酸含量的理论值，且茵陈-大黄1∶1 提取出大黄酸含量显著高于其余组（P＜0.05）。图4（B）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为70%时沉淀中，茵陈-大黄1∶1 时测定的大黄酸的含量高于大黄单味药折算后的大黄酸的含量理论值；其余配伍比例所测定的大黄酸的含量则低于大黄单味药折算后大黄酸含量的理论值，且茵陈-大黄1∶1 提取出大黄酸含量显著高于其余组（P＜0.05）。图4（C）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为80%时的上清液中，茵陈-大黄1∶1、1∶2、2∶1 三种配伍测定的大黄酸含量高于大黄单味药折算后大黄酸含量的理论值；而其余3 种配伍所测定的大黄酸的含量则均低于大黄单味药折算后大黄酸含量的理论值，且茵陈-大黄1∶2提取出大黄酸含量显著高于其余组（P＜0.05）。图D所示：茵陈-大黄1∶1、1∶2 后下两种配伍测定的大黄酸含量低于大黄单味药折算后大黄酸含量的理论值；而其余4 种配伍测定的大黄酸含量则均高于大黄单味药折算后大黄酸含量的理论值，且茵陈-大黄1∶2提取出大黄酸含量显著高于其余组（P＜0.05）。

图4 大黄酸含量的测定结果

2.2.3 芦荟大黄素结果测定

如图5（A）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为70%时的上清液中，茵陈-大黄1∶1 后下、1∶2 后下两种配伍测定的芦荟大黄素含量低于大黄单味药折算后芦荟大黄素含量的理论值；而其余配伍所测定的芦荟大黄素的含量则均高于大黄单味药折算后芦荟大黄素含量的理论值，且茵陈-大黄1∶1 提取出芦荟大黄素的含量显著高于除茵陈-大黄1∶2 外的其余组（P＜0.05），与茵陈-大黄1∶2 无显著差异（P＞0.05）。图5（B）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为70%时的沉淀中，茵陈-大黄1∶1、1∶2、2∶1 3种不同配伍比例按照大黄同时下以及大黄后下测定的芦荟大黄素的含量均高于大黄单味药折算后芦荟大黄素含量的理论值，且茵陈-大黄2∶1 提取出芦荟大黄素的含量显著高于其余组（P＜0.05）。图5（C）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为80%时的上清液中，茵陈-大黄1∶1、1∶2、2∶1 3 种不同配伍比例按照大黄同时下以及大黄后下测定的芦荟大黄素含量均低于大黄单味药折算后芦荟大黄素含量的理论值，且茵陈-大黄1∶2 提取出芦荟大黄素的含量显著高于其余组（P＜0.05）。图5（D）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为80%时的沉淀中，茵陈-大黄1∶1、1∶2、2∶1 三种不同配伍比例按照大黄同时下以及后下测得的芦荟大黄素含量均高于大黄单味药折算后芦荟大黄素含量的理论值，且茵陈-大黄2∶1提取出芦荟大黄素的含量显著高于其余组（P＜0.05）。

图5 芦荟大黄素含量的测定结果

2.2.4 总蒽醌成分含量测定

如图6（A）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为70%时的上清液中，茵陈-大黄1∶1、1∶2、2∶1 3 种不同配伍比例按照大黄同时下以及大黄后下测定的总蒽醌成分的含量均高于折算后总蒽醌成分含量的理论值，且茵陈-大黄1∶1 提取出总蒽醌含量显著高于其余组（P＜0.05）。图6（B）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为70%时的沉淀中，茵陈-大黄1∶1和2∶1两种配伍测定的总蒽醌成分的含量高于折算后总蒽醌成分的含量的理论值；而其余4 种配伍测定的总蒽醌成分的含量均低于折算后总蒽醌成分的含量的理论值，且茵陈-大黄1∶1提取出总蒽醌含量显著高于其余组（P＜0.05）。图6（C）所示：水煎醇沉法醇沉浓度为80%时的上清液中，茵陈-大黄1∶2、2∶1 两种配伍测定的总蒽醌成分的含量均高于折算后总蒽醌成分含量的理论值；而其余四种配伍测定的总蒽醌成分含量均低于折算后总蒽醌成分的含量的理论值，且茵陈-大黄1∶2 提取出总蒽醌含量显著高于其余组（P＜0.05）。图D所示：水煎醇沉法醇沉浓度为80%时的沉淀中，茵陈-大黄1∶1、1∶2、2∶1 三种不同配伍比例按照大黄同时下以及大黄后下测定的总蒽醌成分的含量均高于折算后总蒽醌成分的含量的理论值，且茵陈-大黄1∶2提取出总蒽醌含量显著高于茵陈-大黄2∶1的其余组（P＜0.05），与茵陈-大黄2∶1无显著差异（P＞0.05）。

图6 总蒽醌成分含量的测定结果

3 讨论

3.1 茵陈-大黄药对不同配伍比例对绿原酸含量的影响

绿原酸（chlorogenic acid，CGA）是一种酚酸类化合物，由咖啡酸的1 位羧基和奎尼酸的3 位羟基缩合而成，是植物细胞通过有氧呼吸经莽草酸途径合成的一种苯丙素类物质，具有抗氧化、抗炎、抗菌、保护肝脏的作用。众多研究发现，添加CGA 在提高猪的生长性能、抗氧化能力、增强其机体免疫力以及肠道屏障等方面有重要作用[6]。王宇等[13]研究发现，日粮中添加250、500、1 000 mg/kg CGA 后，断奶仔猪的小肠指数和小肠绒毛/隐窝比均有所增加，肠道形态得到改善。Chen 等[14]研究表明，在日粮中添加600 mg/kg CGA可以通过抑制炎症反应、提高抗氧化能力和改变盲肠微生物群组成来改善急性热应激损伤。

试验得出，在水煎提取法中，茵陈-大黄1∶1、1∶2、2∶1三个不同配比按照大黄同时下以及大黄后下测定的绿原酸含量均高于茵陈单味药的含量，且茵陈-大黄配伍比例为1∶1 时测定的绿原酸含量最高。韩晋等[15]试验得出茵陈与大黄合煎后，绿原酸的含量提高，本试验结果与此结果相似。因此，可以说明，在水煎法提取工艺中，茵陈与大黄两者配伍后，对绿原酸的溶出率均有促进作用，且最佳配比为茵陈-大黄1∶1。

在水煎醇沉提取方法中，醇沉浓度为70%时的沉淀中，测定的绿原酸含量均高于茵陈单味药的含量，且茵陈-大黄配伍比例为1∶1 时测定的绿原酸含量最高。刘丽清等[16]研究得出，绿原酸的最佳醇沉浓度为70%，该试验的结果显示醇沉浓度为70%，提取绿原酸的含量最高。因此，在水煎醇沉法提取工艺中，茵陈与大黄两者配伍后，对绿原酸的溶出率均有促进作用，且最佳配比为茵陈-大黄1∶1。

3.2 茵陈-大黄药的不同配伍比例对蒽醌类成分含量的影响

蒽醌类成分是目前大黄中研究最多的活性成分，同时也是大黄中的主要活性成分。芦荟大黄素是蒽醌类成分之一。刘美艳等[17]研究发现，芦荟大黄素可抑制大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等生长。

在水煎提取法中，茵陈与大黄配伍比例为1∶1、1∶2、2∶1时总蒽醌成分的含量高于大黄单味药的含量，且茵陈-大黄配伍比例为1∶2 时总蒽醌成分含量最高；而茵陈-大黄配伍比例为1∶1后下和1∶2后下时总蒽醌成分含量低于大黄单味药的含量，可能由于大黄后下煎煮时间过短，蒽醌类成分没有完全溶出。有研究表明，大黄中的结合型蒽醌及鞣质等成分均既溶于水又溶于醇，但大黄中的游离型蒽醌及茵陈中具有保肝活性的香豆素类成分极性较小，易溶于醇难溶于水[18]，因此我们要考虑后期的提取工艺。

在水煎醇沉提取方法中，醇沉浓度为70%时的上清液中，茵陈-大黄的配伍为1∶1 时总蒽醌成分测定的含量最高。醇沉浓度为70%时的沉淀中，茵陈-大黄1∶1时总蒽醌成分测定的含量最高。

醇沉浓度为80%时的上清液中，茵陈-大黄1∶2时总蒽醌成分测定的含量最高。在醇沉浓度为80%时的沉淀中，茵陈-大黄的配伍为1∶2 时总蒽醌成分测定的含量最高。

由于在醇沉浓度为80%时，沉淀中的6 个全部配伍比例及上清液中同时下的3 个配伍比例中的总蒽醌成分的含量均增高，可以说明不同配伍比例及大黄的加入时间对大黄蒽醌类成分的含量具有一定的影响性，刘永涛等[19]试验研究数据表明：大黄的泻下成分蒽醌类成分在15～20 min达到最大值；因此，大黄加入的时间也决定了蒽醌类成分的释放量。试验表明，茵陈-大黄的配伍比例为1∶2 时，提取到蒽醌类成分的含量最高，这与张永红[20]实验得出，大黄蒽醌类成分的最佳醇沉浓度为80%，与试验结果相一致。

上述的试验结果表明，茵陈-大黄配伍后，无论是采用水煎法亦或是水煎醇沉法，所得到的绿原酸和蒽醌类成分的含量均高于单味药所得到的。由于传统中药复方汤剂在使用上的不便等原因，近年来单味中药精制颗粒开始用于临床。单味中药精制颗粒是将批量的单味中药饮片分别加水煎煮、浓缩、干燥、分装。使用时按处方混合；开水冲服即得，相当于中药汤剂的分煎。传统中药汤剂是按方配药，加水共煎而得，即合煎。分煎与合煎制得的汤剂，在其化学组成、药效和疗效等方面有什么差别，是单味中药精制颗粒广泛用于临床基础。分煎与合煎制得汤剂的药效学、临床疗效方面已经有了一些报道。但有关其化学组成方面的报道较少。本试验研究证明，茵陈-大黄配伍后，其内部的有效成分均得到提高，但要注意二者的配伍比例，这也间接地反映出配伍在中药方剂中的重要作用。

4 结论

茵陈、大黄配伍后绿原酸含量均有所提高，且水煎法与水煎醇沉法的最佳配伍比例均为1∶1；茵陈与大黄配伍后蒽醌类成分含量也均有所提高，其中大黄酸含量提高最为显著，且水煎法与水煎醇沉法的最佳配伍比例均为1∶2。