干旱胁迫下紫花苜蓿叶片代谢组分析及气孔调节物质的筛选

李 乐, 李丹宁, 杨叶研, 潘新雅, 万懿琦, 张国云, 席杰军, 王亚芳*, 杨培志*

(1. 西北农林科技大学草业与草原学院, 陕西 杨凌 712100; 2. 西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西 杨凌 712100)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)不仅产量高、适应性强、分布广,而且营养价值高、固氮效果好,被誉为“牧草之王”[1-2]。自然环境下,苜蓿根部与根瘤菌共生固氮,可以将大气中游离的氮转化为植物生长发育所需的氮素,为苜蓿提供氮肥,减少氮肥大量施加带来的污染,研究报道,增加植物氮肥摄入能提高植物对干旱等环境胁迫的抵抗力[3]。另外,苜蓿根系发达,在改善生态环境、水土保持方面也具有天然优势[4]。

苜蓿是高耗水类型牧草,每形成1 g干物质需水900～1 000 g[5]。然而,我国苜蓿种植区主要分布在西北、华北、东北以及黄淮海等地区,其中70%属于干旱或半干旱的地区[6]。虽然苜蓿有一定的抗旱能力,但是在灌溉条件下才能获得高产量高品质苜蓿。我国是淡水资源紧缺的国家,随着全球气候变暖,土壤和水分环境逐渐恶化,干旱胁迫也日趋严重[7]。干旱胁迫降低了苜蓿的品质及产量,影响了苜蓿的种植分布,是制约紫花苜蓿产业发展的最主要环境因子[4,8-9]。

干旱作为一种多维胁迫,能够引起植物从表型、生理、生化再到分子水平的一系列变化[10]。干旱胁迫首先引起植物叶片细胞水分亏缺,水分信号转变为植物激素脱落酸(Abscisic aid,ABA)信号[11],能通过减小气孔开度的方式以降低干旱导致的叶片蒸腾作用,调节植物水分平衡[12]。同时植物产生复杂的代谢变化响应维持细胞稳态平衡[13],以避免植物水分失衡、代谢紊乱最终导致的萎蔫死亡,其中涉及信号转导、渗透调控、激素和次生代谢产物等多种途径的调控[14-16]。ABA对提高植物抗旱能力效果明显,是重要的抗蒸腾剂或抗旱诱导因子[17-18],ABA诱导气孔关闭是缓解干旱胁迫的重要途径[15,19]。一方面ABA诱导气孔关闭,提高水分利用效率(WUE:通过蒸腾作用损失的每单位水所获取的碳量)[20],减弱蒸腾作用。另一方面,ABA的积累激发植物的渗透调节、抗氧化系统等代谢变化[21],最终缓解植物遭受干旱胁迫引起的渗透胁迫[22-23]与氧化胁迫等代谢功能障碍[17]。因此,ABA是植物应答干旱胁迫的重要激素[17],也是有效的抗蒸腾剂[20],另外研究发现水杨酸钠(Sodium salicylate,NaSA)、乙烯(Ethylene,ET)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)等代谢物质对气孔也有调控作用。然而,对于干旱胁迫下紫花苜蓿叶片的代谢变化以及外源差异代谢物对气孔的调控作用缺少相关报道。因此,本研究阐明干旱胁迫下紫花苜蓿叶片的代谢物变化,从中筛选影响叶片蒸腾和气孔开度的物质,为开发苜蓿气孔调节物质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

紫花苜蓿‘雷达克之星’(MedicagosativaL. ‘Ladak+’)和苜蓿专用根瘤菌制剂多萌(Rhizobiummelilotistrain Dormal)购买自北京克劳沃种业有限公司。

1.2 试验处理

1.2.1种子萌发 种子萌发采用暗发芽。挑选饱满的紫花苜蓿种子用70%乙醇溶液浸泡消毒15 min,蒸馏水冲洗5次后置于铺有无菌滤纸的培养皿中,用锡纸完全包裹培养皿进行暗发芽,4℃春化2 d后置于人工气候室中(温度25℃,空气相对湿度40%)培养5 d,种子萌发期间,每隔12 h适当补充蒸馏水,以保证滤纸持续湿润、种子正常吸胀[24]。

1.2.2苜蓿苗期培养与根瘤菌接种 将子叶完全展开的健康幼苗移栽到装有100 目无菌石英砂的培养钵(高18 cm×上直径10 cm×下直径8 cm,已灭菌)中,放置人工气候室中培养,生长环境为温度25℃,空气相对湿度40%,16 h光照,光照强度为122.4 μmol·m-2·s-1。为模拟自然状态下紫花苜蓿与根瘤菌共生固氮的生长状态,苜蓿移栽后7 d(苜蓿幼苗生长约3 cm)接种一次根瘤菌,30 d二次接种根瘤菌。每天浇灌无氮Hoagland营养液以激活根瘤固氮作用[24-25]。生长期间在60 d刈割一次,苜蓿培养至90 d进行干旱处理,此时苜蓿根部形成具有固氮活性的粉红色根瘤[26-27]。

1.2.3苜蓿干旱处理 采用埋干砂脱水法对苜蓿进行模拟干旱处理。以前期研究[28]为依据,采用0 h,3 h,8 h埋干砂脱水处理模拟干旱胁迫前(D0),轻度干旱(D1),重度干旱(D2)。待苜蓿生长至90 d,将苜蓿尽量无损伤地从培养钵中拔出,然后将根部的沙子用缓流水冲洗干净,根部轻柔地包裹在吸水纸(18 cm×18 cm)中吸干水分(此时为D0的采样时间点),将D1,D2处理组的苜蓿根部放入培养钵并将其装满无菌100目干燥石英砂,分别进行3 h,8 h的脱水处理,并且在脱水胁迫后3 h(D1),8 h(D2)采样。

在每个处理组中随机选取3株苜蓿叶片混合成1个重复,每组5个重复,每个处理组15株苜蓿。将采集的苜蓿叶片迅速放入液氮中,所有样品均保存在—80℃,用于叶片代谢组检测。

1.3 苜蓿叶片代谢组测定

通过采用超高效液相色谱-串联质谱(Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)方法分析对苜蓿叶片进行广泛非靶向代谢组鉴定。代谢组检测方法采用Waters ACQUITY超高效液色谱(UPLC)和Thermo Scientific Q-Exactive高分辨率/精确质谱仪,该质谱仪与加热电喷雾电离(HESI-II)源和Orbitrap质谱仪连接,以35 000质量分辨率运行。将样品提取物干燥,然后按照以下四种方法的需要准备样品溶液,准备标准品以确保注射和色谱一致性。(1)第一份等分试样使用酸性正离子条件分析,色谱优化以获得更多亲水性化合物。在该方法中,使用含有0.05%全氟辛酸(PFPA)和0.1%甲酸(FA)的水和甲醇从C18柱(Waters UPLC BEH C18-2.1 mm×100 mm,1.7 μm)梯度洗脱提取物。(2)第二份等分试样使用酸性正离子条件进行分析,并且对其进行色谱优化,以获得更疏水的化合物。在该方法中,使用甲醇、乙腈、水、0.05% PFPA和0.01% FA从上述相同的C18柱梯度洗脱提取物,并在总体较高的有机含量下操作。(3)第三份等分试样使用基本负离子优化条件分析,使用甲醇和水以及pH为8.0的6.5 mmol·L-1碳酸氢铵从单独的专用C18柱中梯度洗脱碱性提取物。(4)第四份等分试样通过负电离分析。使用由水和乙腈与10 mmol·L-1甲酸铵(pH 10.8)组成的梯度,从HILIC柱(Waters UPLC BEH Amide 2.1 mm×150 mm,1.7 μm)洗脱提取物。

1.4 外源施加差异代谢物

通过外源施加差异代谢物,测定苜蓿离体叶片的蒸腾量和气孔开度,快速探索代谢组筛选的差异代谢物对气孔开闭的影响。测定的差异代谢物有:脱落酸、棉子糖(Raffinose,RAF)、维生素B6(Pyridoxate,VB6)、烟酰胺(Nicotinamide,VB3)、脱氢抗坏血酸(Dehydroascorbate,DHA)、熊果苷(Hydroquinone beta-D-glucopyranoside,Arb)、组氨酸(Histidine,His)和脯氨酸(Proline,Pro)。苜蓿生长至90 d左右(方法同1.2.1和1.2.2),在试验前2～3 h确保充足水分供给,选择苜蓿顶端向下完全展开的第3～6片完整复叶,在水中剪取以防止在小叶柄处产生气泡,迅速转移到盛满水的圆锥体塑料小容器中(高3.3 cm×上直径6.2 cm×下直径5 cm),容器顶部用塑料膜密封,塑料膜上扎6个小孔,并将合适孔径的枪头插在小孔中以支撑苜蓿叶柄,使苜蓿叶片完全展开并立于小容器内。将装载好的叶片放置在恒温恒湿无风的试验条件(光照强度为122.4 μmol·m-2·s-1,湿度40%,温度25℃)下3 h使气孔完全打开(采用显微镜观察测定),再将叶片转移到装有代谢组筛选的差异代谢物溶液的容器中进行蒸腾量测定和电镜取样。

1.5 苜蓿叶片蒸腾量测定

根据以下公式计算单位叶面积的蒸腾量(Transpiration),每个处理的苜蓿总面积为18个小叶片的扫描面积(每个处理6个复叶,剪去复叶小叶柄),剪取小叶片平置在A4纸上,用透明文件夹(带有标尺)夹住,放置在扫描仪中扫描叶片图像,后用ImageJ测量叶面积。

(1)

式中,Tn是试验第1,2,3,4 h时刻测定的单位叶面积蒸腾量(μg·cm-2);Mn是蒸腾测定1,2,3,4 h后的称重量;M0是装载6个叶片和处理液的装置的初始称重量;LA指每个处理(6个叶片)的总叶面积。

1.6 苜蓿叶片气孔开度的观测

1.6.1电镜生物样品制作 取经过外源差异代谢物处理4 h(同1.4)的苜蓿叶片,置于预冷的4%戊二醛溶液中,4℃过夜固定,经过乙醇梯度脱水,丙酮置换浸透放入二氧化碳临界点干燥仪中进行干燥,粘台喷金后,在S-4800扫描电镜下观察叶片表皮气孔形态特征,选取3 500倍及500倍视野照相。每片叶随机观察5个视野,每个处理重复5次。

1.6.2气孔开度测定 观察500 倍电镜视野范围内的气孔开度,用imageJ随机测量每个处理的30个细胞的气孔长和宽,按照电镜视野标尺的大小换算出实际气孔的数值,将气孔开度定义为宽/长。

1.7 统计数据及分析

使用Metabolon的硬件和软件提取代谢组原始数据,采用(FDR)计算统计显著性(P值),P<0.05,P<0.01的代谢物被认为是不同比较组间的显著,极显著的差异代谢物,后续进行主成分分析(PCA)、维恩图(venny3.1.0)等统计分析。

利用照度计TES1330A测量光照强度,采用扫描仪(SONY FDR-AX60)扫描叶片图像,利用ImageJ测量软件测定叶面积、气孔开度,用SPSS 24分析软件进行单因素方差分析,多重比较采用LSD检验,采用Excel整理数据、做图。

2 结果与分析

2.1 苜蓿叶片代谢组分析

2.1.1样本质控分析 对不同程度干旱胁迫下紫花苜蓿叶片进行广泛非靶向代谢组检测。依据紫花苜蓿叶片代谢组主成分分析(PCA)可知(图1),主成分1和主成分2能够将不同程度的干旱处理组分开,说明干旱胁迫引起苜蓿叶片代谢组发生变化;而每个处理的5个重复聚成一簇,说明样品的重复性较好。

图1 不同程度干旱胁迫下紫花紫花苜蓿叶片主成分分析(PCA)

2.1.2干旱胁迫下苜蓿叶片代谢物变化 代谢组检测出211种代谢物,分为以下8类(图2):氨基酸类(Amino acid)(68种,32.23%),脂类(Lipids)(44种,20.85%),糖类(Carbohydrate)(43种,20.38%),核苷酸类(Nucleotide)(16种,7.58%),辅因子、辅基、电子载体类(Cofactorsor Prosthetic Groups or Electron Carriers)(15种,7.11%),肽类(Peptide)(12种,5.69%),次生代谢类(Biosynthesis of secondary metabolites)(11种,5.21%),激素代谢类(Hormone metabolites)(2种,0.95%)。

图2 不同程度干旱胁迫下紫花苜蓿叶片代谢组鉴定出的代谢物分类

对211个代谢物依据P<0.05筛选出99个差异代谢物。与轻度干旱(D1)相比,重度干旱(D2)胁迫下鉴定出更多的差异代谢物,且干旱胁迫下含量升高的(上调)差异代谢物数量高于含量降低的(下调)差异代谢物(表1)。

表1 不同程度干旱胁迫下紫花苜蓿叶片差异代谢物数量

代谢途径分析表明,这些差异代谢物参与了苜蓿叶片的碳氮代谢。光呼吸(Photorespiration)是植物碳氮代谢的重要过程,而光呼吸的碳主要以氨基酸的方式输出。氨基酸代谢是干旱胁迫下苜蓿叶片中产生差异代谢物质最多的途径(图3),83%的氨基酸显著上调(P<0.05),大量氨基酸积累,其中丝氨酸(Serine)、组氨酸等物质的含量随着干旱胁迫程度的加深不断升高。

图3 不同程度干旱胁迫下紫花苜蓿叶片差异代谢物分类

干旱导致植物体糖酵解(Lycolysis,EMP)水平降低,糖酵解途径的关键物质葡萄糖(Glucose)、6-磷酸葡萄糖(Glucose-6-phosphate,G6P)、丙酮酸盐(Pyruvate)的含量均显著降低(P<0.05)(图3)。因此,干旱胁迫引起了苜蓿叶片的“碳饥饿”。干旱胁迫下,氨同化代谢(Ammonia assimilation metabolism)的关键代谢物质谷氨酰胺(Glutamine)、脯氨酸以及鸟氨酸(Ornithine)含量显著上调(P<0.05),说明干旱胁迫加剧植物体内氨同化途径代谢。代谢产物鸟氨酸上调进而导致多胺(Polyamines,PA)物质精氨酸(Arginine)和5′-甲硫基腺苷(5′-methylthio adenosine,MTA)含量显著上调(P<0.05)。干旱胁迫下苜蓿叶片的氮积累增加。因此,干旱胁迫引起苜蓿叶片中糖酵解、碳反应(Calvin cycle)水平降低,氨同化和多胺水平上升,从而导致碳氮代谢失衡。

干旱引起苜蓿叶片激素含量变化。轻度(D1)、重度干旱(D2)处理下,苜蓿叶片中脱落酸盐均显著上调(P<0.05),说明干旱胁迫诱导ABA含量的积累。愈伤酸(Traumatic acid,TA)是植物体内由磷脂类(Phospholipids)产生的一种非生物胁迫应激反应激素,其含量在干旱胁迫下不断积累,在重度干旱处理下达到显著差异(P<0.05)。

干旱胁迫下,植物叶片谷胱甘肽循环(GSH Cycle)以及抗氧化物质含量增加,以缓解干旱胁迫引起的氧化损伤。GSH代谢中的关键物质5-氧代脯氨酸(5-oxoproline)、丝氨酸上调,乙酰丝氨酸(O-acetyl-serine)显著下调(P<0.05),说明干旱胁迫下谷胱甘肽循环加剧。另外,干旱引起苜蓿叶片中维生素E(Alpha-tocopherol)、脱氢抗坏血酸、VB6等抗氧化剂显著上调(P<0.05)。

干旱胁迫下,棉子糖家族低聚糖(RFOs)代谢增强以缓解干旱胁迫引起的渗透胁迫。干旱胁迫导致苜蓿叶片中大部分的糖类物质含量显著上调(P<0.05)(图3),RFOs包括甜菜苷(Galactinol)、棉子糖(Raffinose)、山梨醇(Sorbitol)含量显著上调(P<0.05),肌醇(Myo-inositol)含量显著上调(P<0.05),说明干旱胁迫下,植物细胞不断积累渗透调节物质保持膨压维持细胞活性和膜运输的正常运转,提高植物抗性。然而,这些RFOs的积累是以降低其它碳循环的关键物质含量为代价的,例如糖酵解途径的葡萄糖(Glucose)、G6P(Glucose 6-phosphate)、草酰乙酸途径的天冬氨酸(Aspartate)、谷胱甘肽循环的甜菜碱(Betaine)、碳反应中的关键代谢物甘油酸盐(Glycerate)等含量的显著降低(P<0.05)。

总之,干旱胁迫引起苜蓿叶片中碳缺乏、氮积累继而导致碳氮代谢失衡;干旱胁迫引起苜蓿叶片中ABA、愈伤酸的含量显著增加,并随着胁迫程度的加深而加剧(P<0.05);干旱胁迫增强苜蓿叶片中谷胱甘肽循环,促进棉子糖家族低聚糖(RFOs)明显积累,从而提高苜蓿的抗氧化能力和渗透调节能力。

2.2 外源施加差异代谢物对苜蓿叶片蒸腾和气孔开度的影响

依据代谢物的理化性质和在干旱胁迫下的含量变化,并通过文献查阅这些代谢物对植物的作用,本研究初步筛选了显著变化的差异代谢物质(脱落酸、棉子糖、VB6、烟酰胺、脱氢抗坏血酸、熊果苷、组氨酸和脯氨酸),通过分析外源施加以上差异代谢物对离体苜蓿叶片的蒸腾量和气孔开度的影响,筛选紫花苜蓿的气孔调节物质。

2.2.1ABA对苜蓿叶片蒸腾和气孔开度的影响 代谢组结果显示,轻度和重度干旱胁迫下植物激素ABA含量显著增加,分别对照组的3.80和4.55倍(图3)。因此,本研究首先分析了外源施加ABA对苜蓿叶片单位面积蒸腾量和气孔开度的影响。

随着外源施加ABA浓度的增大,苜蓿叶片单位面积蒸腾量逐渐减小,并随着处理时间的增加更为明显(图4)。ABA浓度达到0.05 μmol·L-1时,苜蓿叶片蒸腾量显著低于对照组(CK,蒸馏水)(P<0.05);ABA浓度达到0.1 μmol·L-1时,叶片蒸腾量显著低于CK及0.05 μmol·L-1ABA处理(P<0.05)。

图4 外源施加脱落酸(ABA)对紫花苜蓿离体叶片的蒸腾量的影响

随着外源施加ABA浓度的增大,苜蓿叶片气孔逐渐关闭(图5a)。外源施加ABA浓度达到0.05 μmol·L-1时,叶片气孔明显关闭,气孔开度显著低于对照组(P<0.05)(图5b)。外源施加ABA浓度达到0.1 μmol·L-1时,气孔几乎完全关闭,气孔开度与CK,0.05 μmol·L-1ABA处理均有显著差异(P<0.05)。因此,外源施加ABA能够诱导苜蓿气孔关闭,降低叶片单位面积蒸腾量。

2.2.2棉子糖协同ABA诱导气孔关闭 轻度和重度干旱胁迫下的紫花苜蓿对比对照组,叶片中的棉子糖含量分别提高了5.37和8.28倍(图3),然而外源施加1 μmol·L-1或1 mmol·L-1RAF 4 h后,单位面积叶片的蒸腾量与对照均无显著差异,说明外源施加RAF对苜蓿叶片蒸腾量无显著影响(图6)。然而,扫描电镜结果显示,外源施加 1 mmol·L-1RAF时,叶片气孔开度显著降低(P<0.05)(图7),表明1 mmol·L-1RAF具有促进叶片气孔关闭的作用,但其促进气孔关闭的效果低于0.05 μmol·L-1ABA。

图6 外源施加棉子糖(RAF)对紫花苜蓿离体叶片的蒸腾量的影响

图7 外源施加棉子糖(RAF)对紫花苜蓿离体叶片气孔开度的影响

为了阐明RAF是否能够协同ABA促进气孔的关闭的作用,测定了外源同时施加RAF和ABA对叶片蒸腾量及气孔开度的影响。结果表明,外源同时施加1 mmol·L-1RAF和0.05 μmol·L-1ABA 3 h后,叶片蒸腾量显著低于0.05 μmol·L-1ABA(P<0.05)(图6)。扫描电镜结果显示,外源同时施加RAF和ABA时,苜蓿叶片气孔完全关闭,气孔开度显著低于单独施加ABA与单独施加1 mmol·L-1的RAF(P<0.05)。因此,RAF促进了ABA诱导的气孔关闭。

2.2.3VB6抑制ABA诱导的气孔关闭 轻度和重度干旱胁迫下的紫花苜蓿对比对照组,叶片中的VB6含量分别提高了1.89和2.71倍(图3),然而外源施加1 μmol·L-1,10 μmol·L-1VB64 h后,单位面积叶片的蒸腾量与对照均无显著差异,说明外源施加VB6对苜蓿叶片蒸腾量无显著影响(图8)。扫描电镜结果表明,外源施加10 μmol·L-1VB6时,叶片气孔开度显著高于对照(P<0.05)(图9),表明VB6具有促进苜蓿叶片气孔打开的作用。

图8 外源施加维生素B6(VB6)对紫花苜蓿离体叶片蒸腾量的影响

图9 外源施加维生素B6 (VB6)对紫花苜蓿离体叶片气孔开度的影响

外源同时施加10 μmol·L-1VB6和0.1 μmol·L-1ABA时,叶片蒸腾量显著高于单独施加0.1 μmol·L-1ABA(P<0.05)。扫描电镜结果表明同时施加VB6和ABA时,气孔开度显著大于单独施加ABA处理(P<0.05)。因此,外源施加VB6能够抑制ABA诱导的气孔关闭,增加气孔开度,提高叶片的蒸腾量。

通过对苜蓿离体叶片外源施加差异代谢物质发现,外源ABA诱导气孔关闭;外源RAF能够促进气孔关闭,与ABA具有协同作用;外源VB6能够促进气孔打开,抑制ABA诱导的气孔关闭。此外,我们还分析了外源施加其它差异代谢物质对苜蓿叶片单位面积蒸腾量的影响,发现烟酰胺、熊果苷、脱氢抗坏血酸、脯氨酸、组氨酸等对苜蓿离体叶片蒸腾量无显著影响。

3 讨论

研究表明,干旱胁迫下,植物产生复杂的代谢动态响应,以减少水分散失来维持植物的生长发育[14,16],其中涉及激素代谢、碳氮代谢、RFOs积累及其它物质代谢、渗透调节等多种途径的调控[12,15]。本研究结果显示,在干旱胁迫下,紫花苜蓿叶片中大量代谢物积累,引起碳代谢相关的糖酵解水平降低、碳反应减弱,氮代谢相关的氨同化代谢加剧、多胺水平上升,导致植物体内碳氮代谢失衡,这与以往研究一致[12,14-16]。干旱胁迫下,植物的生存和生长均依赖于叶片气孔对碳获取和蒸腾的调控[29],其中植物维持碳平衡的能力与代谢物含量的变化相关[30]。研究表明,脱落酸[22-23]等激素、脯氨酸[25]等渗透调节物质能提高苜蓿抗旱能力[12],本研究结果显示,干旱胁迫下,紫花苜蓿叶片中ABA、愈伤酸等激素含量,渗透调节物质(棉子糖、脯氨酸等)以及抗氧化物质(VB6等)不断积累,对提高苜蓿的抗旱能力积极作用。

干旱诱导ABA积累调控植物气孔开度以减少水分蒸腾从而提高植物抗旱性[10]。大量的分子生物学和生理学研究已经阐明了ABA调控气孔开闭的机制[31]。研究表明,气孔运动实际上可能由抗逆诱导因子ABA[17-18]与多种物质例如赤霉素(Gibberellin,GA)、乙烯、水杨酸等共同控制[32-33],而干旱引起的差异代谢物质与ABA在调控气孔方面是否有关系值得讨论。本研究探讨了苜蓿叶片中的渗透调节物质RAF、脯氨酸以及抗氧化物质VB6等在干旱胁迫下显著积累的差异代谢物对苜蓿叶片蒸腾和气孔开度的影响及其与ABA的关系。植物在干旱胁迫下积累各种有机物质、无机物质,调节体内代谢物质的变化以降低细胞渗透势即渗透调节,缓解细胞渗透压失衡导致的代谢活动紊乱[34-36],对于保持植物叶片的含水量,保持膨压,维持细胞活性和膜运输的正常运转,在维持气孔开度、稳定光合速率以及保持细胞继续生长有重要作用[37-38],本研究结果显示,苜蓿叶片不断积累脯氨酸、棉子糖、甜菜碱等渗透调节物质以缓解干旱导致的渗透胁迫。代谢组分析结果发现,干旱胁迫下,紫花苜蓿叶片中多种RFOs物质含量升高,且重度干旱下RFOs含量升高较轻度干旱更为显著。研究表明,RFOs是植物体在胁迫下产生的一类不影响细胞正常代谢过程的保护性渗透调节物质[34],同时RFOs也参与了碳的运输和储存[38],RFOs物质的积累不仅参与苜蓿叶片的渗透调节,而且可能与缓解干旱导致的碳氮代谢失衡有关。研究表明,棉子糖是RFOs中的一种功能性低聚糖,普遍存在于所有植物中,在干旱胁迫下迅速积累[34]。本试验的结果显示,外源RAF能够促进苜蓿叶片气孔关闭,并且与ABA具有协同作用。研究表明,在干旱胁迫下,植物体内过度产生活性氧(ROS),对植物造成氧化应激,从而破坏植物的光合机制[13],而植物体内的谷胱甘肽循环加剧、抗氧化物积累能够缓解干旱胁迫引起的氧化损伤[39-41],本试验的结果显示,苜蓿叶片中谷胱甘肽循环加剧,VB6积累等抗氧化物质积累,其中VB6是植物中的有效抗氧化剂,其抗氧化活性甚至高于维生素C或E[42],VB6还是氨基酸生物合成中的重要辅因子[43],在植物生长发育和应对干旱胁迫起着重要作用[24,44-45],同时VB6与ABA途径以及氮代谢之间还存在重要联系[45-46],因此VB6不仅参与苜蓿叶片的抗氧化,而且可能与ABA途径调控气孔运动紧密相关[45]。本试验的结果显示,VB6含量随着干旱胁迫程度的加深不断积累,而且外源VB6能够促进苜蓿叶片气孔打开,抑制ABA诱导的气孔关闭,与ABA有拮抗作用。本研究以干旱胁迫下苜蓿叶片代谢组分析为基础,进一步证实差异代谢物质RAF,VB6在气孔调控方面有不同作用,并且与ABA有关,对提高苜蓿抗旱性研究提供了一些思考,然而,RAF和VB6调控苜蓿气孔的机制尚不清楚,对于气孔调节剂的开发缺乏更加深入的产品研究及推广实践。

4 结论

干旱胁迫引起紫花苜蓿叶片碳氮代谢失衡,脱落酸、愈伤酸含量显著增加,并随着胁迫程度的加深而加剧;干旱胁迫增强谷胱甘肽循环,促进棉子糖家族低聚糖(RFOs)等物质明显积累,从而提高苜蓿的抗氧化能力和渗透调节能力。外源棉子糖能够促进紫花苜蓿叶片气孔关闭,并且棉子糖与脱落酸具有协同作用,能够促进脱落酸诱导的气孔关闭;维生素B6能够促进气孔打开,并且维生素B6与脱落酸具有拮抗作用,能够抑制脱落酸诱导的气孔关闭。