硒引发对紫花苜蓿幼苗抗氧化特性的影响

夏方山, 王 勃, 阴禹舟, 李尹琳, 岑慧芳, 朱慧森

(山西农业大学草业学院, 山西 太谷 030801)

硒是人类和动物身体健康不可或缺的微量元素,是人类和动物机体抗氧化和免疫调节系统发挥作用的重要活性成分,被称为“抗癌之王”[1-2]。人类机体内一旦硒缺乏就会诱导克山病、大骨节病、白肌病、不孕等一系列疾病的发生[3]。然而,硒在人类或动物体内无法自主合成,必须从食物中获取,致使土壤缺硒造成的人类健康问题是世界各国共同关注的一个公共卫生焦点[1,4-5]。因此,如何科学生产富硒动植物产品,解决人体缺硒问题是当下食物安全研究的热点领域之一[6-7]。研究发现,适宜的硒处理不仅能促进小麦(Triticumaestivum)[8]、水稻(Oryzasativa)[9-10]、玉米(Zeamays)[11]、燕麦(Avenasativa)[12]等植物的生长发育,还能提高其硒含量、产量和品质,从而能够为人类提供丰富的优质富硒食物来源。植物体内抗氧化能力的提升是外源硒处理实现上述功能的重要原因,这已在玉米[11]、花生(Arachishypogaea)[13]、白术(Atractylodesmacrocephala)[14]、黄精(Polygonatumsibiricum)[15]、葡萄(Vitisvinifera)[16]及青花菜(Brassicaoleracea)[17]等多种植物中得到证实。然而,过度的硒处理也会导致植物发生剧烈的生理变化及物质转换,从而降低其产量[12,18]。所以,硒浓度、作用时间及处理方式就成为了决定富硒农产品生产成败的关键因素[19-20]。种子引发是一种控制浓度及作用时间最简单、经济而有效的生物强化策略,其不仅能促进植物种子的萌发及其幼苗的生长发育,还能提高植物的逆境适应能力[21-22]。因此,硒引发已被广泛用作富硒农产品生产的生物强化策略[4,23]。

紫花苜蓿(Medicagosativa)具有产量高、营养价值丰富、适口性好、消化率高等优良特点,成为享誉全球的“牧草之王”[24-25],是近年来“中央一号”文件和“粮改饲”等政策优先发展的牧草资源[26]。牧草中硒含量不仅与草食动物饲养及畜群健康有密切关系,还会间接影响到人类的身体健康,因而富硒苜蓿草产品生产受到世界各国的共同关注[27]。适量施硒不仅能促进紫花苜蓿的生长发育,还可提高其饲草产量和品质,而过量施硒则相反[28-29]。目前,紫花苜蓿富硒策略研究已经涉及土壤施肥[30]、叶面喷施[28]及种子引发[23,31]等多种形式。研究发现,土壤基施和叶面喷施硒肥既可增加紫花苜蓿叶片的抗氧化能力,又可提高紫花苜蓿的产量和品质[28-30]。硒引发也能提高紫花苜蓿种子的抗氧化能力[31],但其对不同品种紫花苜蓿种子抗氧化能力的影响存在差异[20],而且紫花苜蓿幼苗的抗氧化能力对硒引发如何响应尚未见报道。因此,试验以发芽第10 d的紫花苜蓿幼苗为材料,分析不同浓度亚硒酸钠溶液引发不同时间后其幼苗抗氧化酶活性及脂质过氧化的变化规律,以期揭示硒浓度和引发时间对紫花苜蓿幼苗抗氧化能力的影响,为富硒紫花苜蓿产品的科学生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

供试紫花苜蓿品种为‘偏关苜蓿’,种子由山西农业大学草类植物育种与种子科学实验室于2018年10月在校内试验站收集,并密封保存于—20℃种子库内至2021年3月试验进行。

1.2 硒引发处理

将饱满均匀的紫花苜蓿种子分别置于浓度为0,0.5,1.0,2.0,4.0和8.0 mmol·L-1的亚硒酸钠溶液中(亚硒酸钠溶液浓度筛选参照参考文献[31]),在20℃条件下浸泡0(CK),3,6,9和12 h后,用蒸馏水快速冲洗3遍,并用滤纸吸收种子表面水分后于25℃黑暗条件自然风干至含水量为10%(鲜重基础)左右,于4℃条件下密封保存备用。

1.3 发芽试验

发芽条件及发芽率的计算参照国际种子检验协会制定的种子检验规程(2019)[32]进行,随机选取100粒引发后的种子,放入铺有2层滤纸的培养皿并加入5 mL蒸馏水,于20℃恒温光照培养箱中培养10 d,最终获得试验所需幼苗样品。每个处理重复4次。

1.4 生理指标测定

粗酶液提取参照Kibiza等[33]的方法,发芽第10 d准确称取0.1 g幼苗,冰浴研磨后上清液于4℃条件保存备用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性参照Rao等[34]的方法测定,过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性参照Aebi[35]的方法测定,抗坏血酸过氧化物酶(Aseorbate peroxidase,APX)活性参照Nakano等[36]的方法测定,谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase,GR)活性参照Madamanchi等[37]的方法测定,丙二醛(Maloddialdehyde,MDA)含量参照Bailly等[38]的方法测定,可溶性蛋白含量采用南京建成科技有限公司所生产的试剂盒测定。

1.5 数据统计与分析

使用SPSS 22.0软件对紫花苜蓿幼苗的各项指标数据进行单因素方差分析,多重比较(P<0.05)则采用Duncan’s法进行,最终以平均值±标准误方式表示结果。

2 结果与分析

2.1 硒引发对紫花苜蓿幼苗SOD活性的影响

由表1可知,浓度为0 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1时,紫花苜蓿幼苗的SOD活性随引发时间的延长呈现逐渐升高的趋势,均显著高于CK(P<0.05),并在引发12 h时显著高于其他引发时间(P<0.05);浓度为1.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1时,紫花苜蓿幼苗SOD活性随引发时间的延长呈先升高后下降的趋势,浓度为1.0 mmol·L-1时引发9 h显著高于其他引发时间(P<0.05),浓度为2.0 mmol·L-1时引发3 h和6 h显著高于其他引发时间(P<0.05),浓度为4.0 mmol·L-1时引发3 h和6 h显著高于其他引发时间(P<0.05),而引发12 h时显著低于其他引发时间(P<0.05),浓度为8.0 mmol·L-1时引发3 h显著高于其他引发时间(P<0.05),引发12 h时显著低于其他引发时间(P<0.05)。相同引发时间下,紫花苜蓿幼苗SOD活性均随浓度的增加呈先升高后下降的趋势;引发3 h时,在浓度为1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1时显著高于其他浓度(P<0.05);引发6 h时,在浓度为1.0 mmol·L-1时显著高于其他浓度(P<0.05);引发9 h时,在浓度为0.5 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1时显著高于浓度为0 mmol·L-1时(P<0.05),并在浓度为2.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1时显著低于浓度为0 mmol·L-1时(P<0.05);引发12 h时,在浓度为0.5 mmol·L-1时显著高于试验中所有处理时(P<0.05),而在浓度为8.0 mmol·L-1时低于试验中所有处理时。

表1 硒引发对紫花苜蓿幼苗SOD活性的影响

2.2 硒引发对紫花苜蓿幼苗CAT活性的影响

由表2可知,浓度为0 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1时,紫花苜蓿幼苗的CAT活性随引发时间的延长呈现逐渐升高的趋势,均显著高于CK(P<0.05);浓度为1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1时,随引发时间的延长呈先升高后下降的趋势,浓度为1.0 mmol·L-1时引发9 h显著高于其他引发时间(P<0.05),浓度为2.0 mmol·L-1时引发3 h显著高于其他引发时间(P<0.05);浓度为4.0 mmol·L-1和8.0 mmol·L-1时,紫花苜蓿幼苗CAT活性随引发时间的延长而下降,均在引发12 h显著低于其他引发时间(P<0.05)。相同引发时间下,紫花苜蓿幼苗CAT活性均随浓度的增加呈先升高后下降的趋势;引发3 h时,紫花苜蓿幼苗CAT活性在浓度为1.0 mmol·L-1时显著高于0.5 mmol·L-1外的其他浓度(P<0.05);引发6 h和9 h时,在浓度为2.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1时显著低于浓度为0 mmol·L-1时(P<0.05);引发12 h时,在浓度为0.5 mmol·L-1时显著高于试验中所有处理时(P<0.05),而在浓度为8.0 mmol·L-1时显著低于试验中所有处理时(P<0.05)。

表2 硒引发对紫花苜蓿幼苗CAT活性的影响

2.3 硒引发对紫花苜蓿幼苗APX活性的影响

由表3可知,浓度为0 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1时,紫花苜蓿幼苗的APX活性随引发时间的延长呈现逐渐升高的趋势,均显著高于CK(P<0.05);浓度为1.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1时,随引发时间的延长呈先升高后下降的趋势;浓度为1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1时均显著高于CK(P<0.05),并分别在引发9 h和3 h时显著高于其他引发时间(P<0.05);浓度为4.0 mmol·L-1和8.0 mmol·L-1时引发3 h时最高,浓度为4.0 mmol·L-1时引发9 h和12 h显著低于CK(P<0.05)。相同引发时间下,紫花苜蓿幼苗APX活性均随浓度的增加呈先升高后下降的趋势;引发3 h时,在浓度为1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1时显著高于其他浓度(P<0.05),但浓度为8.0 mmol·L-1时显著低于浓度为0 mmol·L-1时(P<0.05);引发6 h和9 h时,在浓度为1.0 mmol·L-1时显著高于浓度为0 mmol·L-1时(P<0.05),并在浓度为2.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1时显著低于浓度为0 mmol·L-1时(P<0.05);引发12 h时,在浓度为0.5 mmol·L-1时显著高于试验中所有处理时(P<0.05),而在浓度为8.0 mmol·L-1时显著低于试验中所有处理时(P<0.05)。

表3 硒引发对紫花苜蓿幼苗APX活性的影响

2.4 硒引发对紫花苜蓿幼苗GR活性的影响

由表4可知,浓度为0 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1时,紫花苜蓿幼苗的GR活性随引发时间的延长呈现逐渐升高的趋势,除浓度为0 mmol·L-1引发3 h外均显著高于CK(P<0.05);浓度为1.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1时,随引发时间的延长呈先升高后下降的趋势;浓度为1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1时均显著高于CK(P<0.05),浓度为1.0 mmol·L-1时在引发9 h时显著高于其他引发时间(P<0.05),浓度为2.0 mmol·L-1时在引发3 h时显著高于引发6 h外的其他时间(P<0.05);浓度为4.0 mmol·L-1和8.0 mmol·L-1时均在引发3 h时最高,显著高于CK(P<0.05)。相同引发时间下,紫花苜蓿幼苗GR活性均随浓度的增加呈先升高后下降的趋势;引发3 h时,在浓度为2.0 mmol·L-1时显著高于其他浓度(P<0.05);引发6 h时,在浓度为1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1时显著高于其他浓度时(P<0.05),浓度为8.0 mmol·L-1时显著低于浓度为0 mmol·L-1时(P<0.05);引发9 h时,在浓度为1.0 mmol·L-1时显著高于其他浓度时(P<0.05),浓度为8.0 mmol·L-1时显著低于浓度为0 mmol·L-1时(P<0.05);引发12 h时,在浓度为0.5 mmol·L-1时显著高于试验中所有处理时(P<0.05),在浓度为2.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1时显著低于浓度为0 mmol·L-1时(P<0.05),并在浓度为8.0 mmol·L-1时显著低于试验中所有处理时(P<0.05)。

表4 硒引发对紫花苜蓿幼苗GR活性的影响

2.5 硒引发对紫花苜蓿幼苗MDA含量的影响

由表5可知,浓度为0 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1时,紫花苜蓿幼苗的MDA含量随引发时间的延长呈先升高后降低的趋势,浓度为0 mmol·L-1时,除引发3 h外均显著高于CK(P<0.05),浓度为0.5 mmol·L-1时,除引发3 h外均显著低于CK(P<0.05);浓度为1.0 mmol·L-1时,随引发时间的延长呈先升高后下降再升高的趋势,引发6 h和9 h时显著低于其他引发时间(P<0.05),而引发12 h时显著高于其他引发时间(P<0.05);浓度为2.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1时,随引发时间的延长呈升高趋势,均显著高于CK(P<0.05)。相同引发时间下,引发3 h时,紫花苜蓿幼苗MDA含量均随浓度的增加呈上升趋势;引发6 h～12 h时,均随浓度的增加呈先下降后升高的趋势;引发6 h和9 h时,在浓度为0.5 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1时显著低于其他浓度(P<0.05),在浓度为2.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1时显著高于其他浓度(P<0.05);引发12 h时,在浓度为0.5 mmol·L-1时显著低于试验中所有处理时(P<0.05),在浓度为1.0 mmol·L-1～8.0 mmol·L-1时显著高于浓度为0 mmol·L-1(P<0.05),并在浓度为8.0 mmol·L-1时显著高于试验中所有处理时(P<0.05)。

表5 硒引发对紫花苜蓿幼苗MDA含量的影响

2.6 硒引发对紫花苜蓿幼苗抗氧化性能的双因素方差分析

双因素方差分析表明(表6),不同硒浓度对紫花苜蓿幼苗SOD,APX,GR和MDA均有显著影响(P<0.05),不同硒引发时间紫花苜蓿幼苗SOD,CAT,APX,GR和MDA均有显著影响(P<0.05),而硒浓度和引发时间的交互作用则对SOD,CAT,APX,GR和MDA均有极显著影响(P<0.01)。

表6 硒引发对紫花苜蓿幼苗抗氧化性能的双因素方差分析

3 讨论

硒是调控植物体内抗氧化等代谢反应的重要微量元素,对于植物的逆境损伤修复和富硒生物强化具有重要作用[39],因而适宜的硒处理能促进植物种子的萌发及其幼苗生长[14-15]。外源硒浓度和引发时间是造成种子引发中出现双重效应的关键因素,一般低浓度或短时间的引发处理产生促进作用,而高浓度或长时间引发则往往产生抑制作用[20,31]。研究发现,外源硒引发对紫花苜蓿种子活力也具有双重效应,低浓度(0.5 mmol·L-1)的硒引发促进了紫花苜蓿种子的萌发,其中浓度为0.5 mmol·L-1引发12 h时其种子发芽率显著高于CK(P<0.05),而高浓度则抑制其萌发[31]。本试验中,硒浓度和引发时间的交互作用则对SOD,CAT,APX,GR和MDA均有极显著影响(P<0.01),而且低浓度(0.5 mmol·L-1)的硒引发(3 h～12 h)提高了紫花苜蓿幼苗的SOD,CAT,APX和GR的活性,这是因为低浓度硒处理既提高了植物的抗氧化能力[4],又促进了种子内蛋白质及多糖等贮藏大分子物质的分解[40],从而为其萌发过程中细胞分裂提供了充足的能量和物质基础。然而试验发现,紫花苜蓿幼苗的MDA含量在低浓度(0.5 mmol·L-1)引发时出现先升高后降低的趋势,这可能是因为低浓度硒引发使种子发生了一定程度的吸胀损伤,且初期抗氧化酶活性的升高尚不足以修复这种损伤,因而出现了MDA含量升高的现象[41],直到引发12 h时紫花苜蓿幼苗内抗氧化酶活性的升高才能修复其吸胀损伤。

植物体内抗氧化能力的下降造成了其细胞内引起脂质过氧化损伤的活性氧自由基(Reactive oxide species,ROS)含量升高,表现为其细胞内脂质过氧化损伤的标志性产物MDA含量上升[42]。试验中,高浓度(≥4.0 mmol·L-1)硒引发时间越长,紫花苜蓿幼苗内的SOD,CAT,APX和GR活性越低,其MDA含量则越高,说明高浓度硒引发降低了紫花苜蓿幼苗的抗氧化能力,进而导致其脂质过氧化损伤加剧,这与硒引发对紫花苜蓿种子抗氧化性能的影响研究结论相似[20,31]。此外,这在外源硒处理对玉米[11]、花生[13]、白术[14]、黄精[15]及青花菜[17]等植物幼苗氧化酶活性的影响研究中也到了证实。这可能是因为低强度的外源硒处理通过调控植物细胞内抗氧化系统的防御能力,及时地保持了其体内ROS动态平衡,缓解了细胞膜系统的脂质过氧化损伤,从而表现为其MDA的产生相对较少。过量的硒不仅诱导了引起细胞膜系统脂质过氧化损伤的ROS增多,还对种子内所有需要硫的反应部位产生毒害[43-44],将植物体内无机态的硒转化成有机态的硒代半胱氨酸,并与非特异性蛋白质结合而干扰其正常功能的发挥,最终使植物体内的代谢平衡出现紊乱,从而影响了植物的生长发育[17,43]。本试验中,硒浓度为0.5 mmol·L-1引发12 h时,紫花苜蓿幼苗细胞内SOD,CAT,APX和GR活性均保持最高水平,而其MDA含量却最低,因而这可能是紫花苜蓿草产品富硒生产的最佳处理。

4 结论

外源硒引发对紫花苜蓿幼苗抗氧化能力的影响与其浓度及引发时间均有密切关系。低浓度(≤1.0 mmol·L-1)的外源硒引发能提高紫花苜蓿幼苗的抗氧化性能,从而降低其脂质过氧化损伤;高浓度长时间引发(≥4.0 mmol·L-1,12 h)时,紫花苜蓿幼苗的抗氧化性能下降,而其脂质过氧化损伤加剧。浓度为0.5 mmol·L-1的亚硒酸钠溶液引发12 h时是提高紫花苜蓿幼苗抗氧化能力的最佳处理。