黄梁木精油活性成分测定及其对全株玉米青贮有氧稳定的影响

杨 丹, 吴 硕, 陈丹丹, 张 庆

(1.华南农业大学林学与风景园林学院, 广东木本饲料工程技术研究中心, 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室, 广东 广州 510642)

全株玉米(Zeamays)是一种重要的青贮饲料原料,拥有较高的营养价值,良好的适口性和消化率[1]。全株玉米青贮是反刍动物养殖过程中消耗最多的饲草产品,在畜牧养殖中占有重要地位[2]。然而,全株玉米青贮打开使用时极易发生有氧变败,造成大量干物质损失,甚至产生真菌毒素,滋生致病菌,导致动物的发病甚至死亡。我国全株玉米青贮管理水平低,极易面临有氧变败的问题[3]。

植物精油是在植物中提取的挥发性次生代谢产物,因其抗氧化、抑菌消炎、预防疾病、促进动物生长,防止饲料霉变等功效,在畜牧生产应用广泛[4-5]。植物精油在食品加工中常被用做天然防腐剂,能够对致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等食源性致病菌起抑制作用[6]。同时,添加桉叶精油和迷迭香精油可以降低柱花草青贮pH值,抑制大肠杆菌,提高乳酸含量和蛋白质保存,显著改善了青贮饲料品质[7]。添加山苍子精油可以抑制霉菌,减缓青贮玉米中粗蛋白质和氨基酸的损失[8]。植物精油抑菌效果良好,特别是对引起青贮有氧变败的酵母菌和霉菌等真菌有良好的抑制作用,在提高全株玉米青贮有氧稳定有潜在的应用价值[9]。

黄梁木(Neolamarckiacadamba)是一种起源于热带和亚热带的常绿阔叶乔木,含有丰富的生物活性成分如黄酮、酚类、生物碱、萜类、皂苷、多糖及单宁等,具有抗菌消炎、降血糖、抗腹泻、抗氧化及抗癌等功效,用途极为广泛[10-11]。近年来,因其生长速度快,叶片蛋白质含量高,且富含多种活性成分被广泛用做木本饲料[12-13]。黄梁木叶自然青贮品质pH值可达3.86～4.02,能够有效抑制不良微生物,作为添加剂可以降低苜蓿、柱花草和全株玉米青贮中不良微生物的含量,提高青贮后牧草中蛋白质的保存率[14]。

目前,大多数研究都集中黄梁木提取物的生物活性,据其他学者的研究报道[15],推测黄梁木中可能含有挥发性抑菌活性成分,能够影响青贮中有氧稳定,但关于黄梁木中挥发性活性成分的研究还较少。因此,本研究采用水蒸气蒸馏法在黄梁木鲜叶中提取黄梁木精油,并通过气相-质谱联用探究黄梁木精油主要成分及对全株玉米青贮有氧稳定性的影响,为促进黄梁木在畜牧业中的应用,减少饲料损失和提高全株玉米有氧稳定性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及精油制备

本试验所选用的华美糯玉米和黄梁木种植于华南农业大学启林北试验田。黄梁木精油以黄梁木叶片为原料,采用水蒸气蒸馏法提取。黄梁木叶片冷冻粉碎后置于圆底烧瓶中,加入蒸馏水,蒸馏提取至无油状物馏出为止(料液比1∶2,提取时长约3 h)。将蒸馏出的黄梁木精油以每分钟6 000转的转速离心10 min,除去上层蒸馏水,并用足量的无水Na2SO4干燥后置于4℃冰箱保存备用。

1.2 试验设计

本试验于2022年6月乳熟期人工收割华美糯玉米,用粉碎机将采集材料粉碎成1～2 cm的小段,混合均匀后取1 kg全株玉米装入青贮袋并用真空封口机密封。青贮70天后按照0.625(N1),1.25(N2),2.5(N4)和3.75(N6)mL·kg-1比例添加黄梁木精油,并设立空白对照组(CK)。不同处理组样品混合均匀后装入塑料桶,用一层聚乙烯塑料薄膜覆盖桶,扎出气孔,一共5个处理组,每组3个重复,在室温保存。在有氧暴露第0天和第7天对青贮饲料进行发酵特性、化学成分和有氧稳定性分析。

1.3 测定指标

1.3.1有氧稳定性测定 用温度记录仪(SMOWO MDL-1048A,上海天贺自动化仪表有限公司)监测塑料桶样品中心内的温度和环境温度,设定每隔10 min记录一次温度。有氧稳定性是指青贮温度不高于环境温度2℃的保存时间。

1.3.2微生物数量测定 根据Wang等[16]所述,分别在有氧暴露的第0天和第7天测定了青贮样品的发酵特性和化学成分。将10 g的鲜样加入90 mL无菌生理盐水,摇晃混匀,将上清液从10-1梯度逐层稀释至10-6倍,用平板计数法测定乳酸菌、大肠杆菌和酵母菌的数量。

1.3.3pH值及化学成分测定 取10 g鲜样加入90 mL纯水于4℃冰箱充分浸泡,24 h后取出用定性滤纸过滤,使用雷磁PHS-3C型pH计(上海市精密科学仪器有限公司)测定滤液pH值。采用蒽酮比色法测定可溶性碳水化合物含量[17]。取适量样品,称重记录,置于65℃恒温干燥箱烘干48 h,计算样品烘干后的重量与烘干前的重量的百分比就是干物质含量。称取烘干后粉碎的样品0.5 g,加入适量催化剂(硫酸铜与硫酸钾按1∶5的比例配置)和浓硫酸于420℃消煮2 h,消煮完毕使用全自动凯氏定氮仪测定粗蛋白质含量(Kjeltec8400,美国FOSS)。使用纤维分析仪(2000,英国Ringbio)分析中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量[18]。

1.3.4黄梁木精油成分分析 采用气相-质谱联用(GC-MS)分析黄梁木精油的主要成分。从-80℃冰箱中取出样品进行液氮研磨,涡旋混合均匀,每个样本称取约1 mL于顶空瓶中,加入饱和NaCl溶液和10 μL(50 μg·mL-1)内标溶液,全自动顶空固相微萃取HS-SPME进行样本萃取,以供GC-MS分析。HS-SPME萃取条件:在60℃恒温条件下,震荡5 min,120 μm DVB/CWR/PDMS萃取头插入样品顶空瓶,顶空萃取15 min,于250℃下解析5 min,然后进行GC-MS分离鉴定。色谱条件:DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,Agilent J&W Scientific,Folsom,CA,USA),载气为高纯氦气(纯度不小于99.999%),恒流流速每分钟1.2 mL,进样口温度250℃,不分流进样,溶剂延迟3.5 min。程序升温:40℃保持3.5 min,以每分钟10℃升至100℃,再以每分钟7℃升至180℃,最后以每分钟25℃升至280℃,保持5 min。质谱条件:电子轰击离子源(EI),离子源温度230℃,四级杆温度150℃,质谱接口温度280℃,电子能量70 eV,扫描方式为选择离子检测模式(SIM),定性定量离子精准扫描(GB 23200.8-2016)。

1.4 数据统计与分析

用Excel 2016对数据进行处理,SPSS 23.0对整理好的数据进行单因素方差分析,使用邓肯极差法对各个样本均值之间的差异多重比较,P<0.05为差异显著。使用GraphPad Prism 8、Adobe Illustrator CC2018进行绘制图表。

2 结果与分析

2.1 黄梁木精油的主要成分

通过水蒸气蒸馏法提取的黄梁木精油是一种淡黄色透明油状液体,密度(1.19 g·mL-1)高于水。黄梁木精油经GC-MS检测的总离子流图如图1所示,一共分离鉴定出977种代谢物。主要化学成分名称、相对含量和分类见表1和图3。黄梁木精油成分复杂,含有多种化合物,其中种类较丰富的有萜类219种(22.4%),酯类156种(16.0%),酮98种(10.0%),醇97种(9.9%),杂环化合物97种(9.9%),醛76种(7.7%),烃类75种(7.6%)和芳烃类74种(7.5%)。相对含量较高的化学成分是1,5-二甲基-2,6-双(亚甲基)-环辛烷(34.15%),N-苯基-甲酰胺(23.20%),甲酸芳樟酯(12.09%),(1α,4α,4aα,5aα)-4,4a,5,5a-四氢-6,6-二甲基-1,4-甲基-1H-环丙[d]哒嗪(7.09%),1-甲基-4-硝基-苯(2.32%),4-甲基-苯甲酸(2.19%),L-香30芹醇(1.98%)和5-甲基-2-(1-甲基亚乙基)-环己酮(1.32%)。

表1 黄梁木精油的主要成分名称和相对含量

表3 青贮原料特征

图1 黄梁木精油总离子流图

图2 黄梁木精油主要物质种类占比扇形图

图3 不同处理全株玉米青贮有氧暴露期间温度变化图

2.2 青贮原料的特点

全株玉米新鲜原料的干物质含量为20.09% DM,粗蛋白质含量为9.79% DM。中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和可溶性碳水化合物含量分别为50.25% DM,22.71% DM和17.54% DM。微生物乳酸菌、酵母菌、霉菌和大肠杆菌分别为6.49,4.63,3.59和7.32 lg cfu·g-1FM。

2.3 全株玉米青贮添加黄梁木精油的有氧稳定性

由图3和图4可知,黄梁木精油可以提高全株玉米青贮有氧稳定性,CK组全株玉米青贮有氧稳定性为46.17 h,N1和N2组的有氧稳定性分别为52.17 h和82.5 h。当黄梁木添加量为N4(2.5 mL·kg-1)和N6(3.75 mL·kg-1)时,全株玉米青贮在有氧暴露7天之内均比较稳定,N4处理组的全株玉米青贮在有氧暴露84 h后温度略有升高但低于室温2℃,而N6处理组的全株玉米青贮有氧暴露7天内温度保持和室温一致。在全株玉米青贮中添加2.5 mL·kg-1的黄梁木精油即可保持青贮饲料的有氧稳定性。

图4 不同处理全株玉米青贮有氧稳定

2.4 有氧暴露后全株玉米青贮的发酵品质和化学成分

有氧暴露对全株玉米青贮干物质含量、pH值、乳酸菌数量和酵母菌数量均有显著影响(P<0.05)(表4)。CK组在有氧暴露7天后干物质含量显著降低(P<0.05),从22.24%下降到16.34%。pH值和微生物数量均显著上升(P<0.05)。随着黄梁木精油添加比例的增加,全株玉米青贮的干物质含量显著升高(P<0.05),pH值、乳酸菌数量和酵母菌数量显著降低(P<0.05)。其中,N4处理的干物质、pH值和乳酸菌数量与CK组无明显变化,N6处理组的能够降低全株玉米青贮pH值,达到最低值,为3.88。精油添加组中的大肠杆菌和霉菌数量除N1处理组以外,其他组均未被检测到。

表4 全株玉米青贮有氧暴露后发酵参数和微生物数量

有氧暴露对全株玉米青贮中的蛋白组分和纤维产生显著的影响(表5)。CK组在有氧暴露7天后粗蛋白质含量从9.40%到12.48%,中性洗涤纤维含量从49.18%到61.58%,酸性洗涤纤维含量从21.77%到30.97%,均显著上升(P<0.05)。添加黄梁木精油后,N1,N2,N4组的粗蛋白质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量均显著降低(P<0.05)。当黄梁木添加量为N4(2.5 mL·kg-1)和N6(3.75 mL·kg-1)时,饲料中的粗蛋白质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量与有氧暴露第0天无显著变化。

表5 全株玉米青贮有氧暴露后的营养品质

3 讨论

3.1 黄梁木精油的成分

黄梁木精油成分复杂,含有多种代谢物。大多数植物精油的成分以萜烯类化合物、芳香族化合物和脂肪族化合物等成分为主[19]。黄梁木精油含有相对含量较高的烃类、芳烃和酯类等物质。另外,黄梁木精油还含有种类较丰富的杂环化合物,彭莘媚等[20]发现香豆素杂环化合物具有广泛的生物活性,其结构中的香豆素环和噻唑环对抗真菌活性起促进作用。因此,本研究中相对含量较高的杂环化合物可能是黄梁木精油抑菌效果良好的原因之一。Das等[21]发现,芹菜精油中含量最高的单体化合物乙酸芳樟酯对真菌具有较好的抑菌效果,仅5.5 μL·mL-1的乙酸芳樟酯就能抑制黄曲霉合成黄曲霉毒素。因此,黄梁木精油主要成分之一的甲酸芳樟酯可能对真菌具有较好的抑制效果。将黄梁木精油用于提高全株玉米青贮有氧稳定可能是一条有效的途径。

3.2 青贮前全株玉米鲜料的化学特性和微生物数量

本研究中,全株玉米的DM含量低于已有研究测定的玉米值(DM:27.2%)[22],DM和WSC含量对于青贮至关重要,为乳酸菌提供足够的发酵底物[23]。据Bai等[24]通过对比两种不同水分水平的玉米植株,发现高含水量的全株玉米青贮饲料比低水分的全株玉米青贮饲料表现出更高的有氧稳定性。另外,微生物数量是决定青贮发酵的因素之一,全株玉米的乳酸菌数量已达到良好青贮饲料标准(>5.0 lg cfu·g-1FM)可以进行大量的乳酸发酵[26]。但酵母菌和大肠杆菌的数量与乳酸菌差异变化不显著,可能会影响乳酸菌发酵,产生有害物质,造成蛋白质损失,降低青贮饲料的发酵品质[15]。

3.3 黄梁木精油对全株玉米青贮有氧稳定性的影响

有氧稳定性是评价青贮饲料品质的一个重要指标,由于青贮饲料有氧暴露是无法避免的,往往会导致饲料的营养成分流失、毒素积累,而较高的有氧稳定性可以使青贮保持优良的适口性,营养物质不易被降解[25]。当好氧真菌暴露在空气中大量繁殖生长,乳酸和可溶性碳水化合物等营养物质被消耗,代谢产热,从而青贮饲料的pH值和温度逐渐上升。随着有氧暴露时间延长,青贮温度在好氧真菌旺盛生长期间达到峰值,添加黄梁木精油后显著降低了全株玉米青贮饲料的最高温度[27]。N4处理组的全株玉米青贮在有氧暴露84 h后温度略有升高但低于室温2℃,而N6处理组的全株玉米青贮有氧暴露7天内温度保持和室温一致。这可能是有氧暴露7天后,添加黄梁木精油显著降低了酵母菌数量,抑制好氧真菌生长。当添加2.5 mL·kg-1的黄梁木精油时即可以有效提高全株玉米青贮有氧稳定性。

3.4 有氧暴露阶段黄梁木精油对全株玉米青贮品质的影响

黄梁木精油可以提高华美糯全株玉米青贮有氧稳定性,抑制酵母菌、霉菌等不良微生物的生长,避免干物质的降解[28]。本研究中,添加黄梁木精油很好的抑制了大肠杆菌和霉菌的生长。N2、N4和N6处理的大肠杆菌和霉菌均低于检测值。表明黄梁木精油中的一些活性成分抑菌作用明显,抑制了不良微生物的活性,并且精油添加量越高,抑菌作用更显著。华美糯全株玉米青贮有氧暴露以后,干物质中纤维含量显著升高。纤维含量是评价青贮饲料的一个重要指标,饲料中高含量的粗纤维会降低动物的采食量和干物质消化率,甚至会降低生产性能[29]。本试验中,全株玉米青贮的粗蛋白质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量在有氧暴露阶段显著上升,这可能很大程度上受酵母菌影响。在有氧暴露期间,酵母菌等好氧微生物消耗了青贮中可溶性碳水化合物、维生素等营养物质,造成有氧变质,导致纤维、粗蛋白在干物质中的含量相对上升,纤维含量的升高也表明青贮品质的下降[30-31]。在全株玉米中添加黄梁木精油可以抑制不良微生物的活性,减少营养物质的损失[32]。

4 结论

黄梁木精油成分复杂,含有多种代谢物,其中种类较丰富的有萜类(219种)、酯类(156种)和酮(98种),相对含量最高的化合物是1,5-二甲基-2,6-双(亚甲基)-环辛烷(34.15%)。有氧暴露7天后,添加黄梁木精油可以抑制大肠杆菌、霉菌和酵母菌等不良微生物的活性,减少营养物质的损失,对青贮饲料的有氧稳定具有改善作用。不同添加量的黄梁木精油均可以提高全株玉米(华美糯)青贮的有氧稳定性,当黄梁木精油的添加量为2.5 mL·kg-1即可保持全株玉米青贮有氧稳定性。