镉胁迫对3种草坪草生理特性及叶片超微结构的影响

张秀娟, 范 玟, 杨 乐, 吴 楚, 杨永胜

(1.长江大学园艺园林学院, 湖北 荆州 434025; 2.中国科学院西北高原生物研究所, 青海省寒区恢复生态学重点实验室, 中国科学院高原生物适应与进化重点实验室, 青海 西宁 810001)

随着我国工农业和城镇化的快速发展,工矿业废弃污染物不断排放和农业化学用品过量使用,越来越多的重金属进入土壤,土壤环境污染日益严重。我国土壤重金属总的点位超标率为16.1%,其中镉的点位超标率达7.0%,在无机污染物中位居首位[1]。镉是一种有剧毒的稀有污染重金属,危害动植物及人类的健康[2],且半衰期较长,迁移率较高,生物富集特性较强,属于需要优先控制的重金属污染物[3]。镉胁迫加强植物细胞内固有的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)代谢,若ROS水平超出抗氧化酶的防御机制,将引起植物细胞膜过氧化,叶绿体基粒片层结构排列混乱,细胞器损伤严重,光合色素含量降低[4]。植物修复技术是利用超富集植物来稳定降解土壤中的污染物[5],具有成本低、绿色环保、对环境干扰小等优点[6]。近年来,对镉污染土壤下植物生理特性的研究较多,例如小麦(Triticumaestivum)[7]、玉米(Zeamays)[8]、龙葵(Solanumnigrum)[9]、杞柳(Salixintegra)[10]以及鬼针草(Bidenspilosa)[11]等。然而,选用这些植物在修复镉污染方面存在一定缺陷,一是选用农作物会通过食物链传播危害人类健康,二是因生物量太低而限制了在实际中的应用。利用草坪草修复镉污染的土壤,其产物不会进入食物链且生物量大、安全性强、适用性广[12],同时具备修复治理和美化环境的双重作用[6],因此,草坪草修复镉污染土壤具有独特优势。

白三叶(Trifoliumrepens)为豆科车轴草属草坪草,具有适应性强,耐热、耐旱、耐寒、耐贫瘠等优点,是极为重要的优质牧草和观赏型草坪草。禾本科的高羊茅(Festucaarundinacea)和黑麦草(Loliumperenne)是有重要农学价值的冷季型草坪草,其根系发达、适应范围广、抗逆性强,广泛用于绿地草坪和运动场草坪,同时也可作为牧草和绿肥作物。已有研究发现这3种草坪草对重金属有一定的耐受能力[13-15],均有修复重金属污染土壤的潜力。因此,本研究以白三叶、高羊茅、黑麦草为试验材料,探讨这3种草坪草受到镉胁迫后的生理特性及叶片细胞超微结构的变化,从生理学和细胞学上揭示镉对草坪草的毒害机理,以期为利用草坪草修复镉污染的土壤提供科学依据。

1 材料及方法

1.1 试验材料

本试验中白三叶(‘法海’)、高羊茅(‘凯撒’)、黑麦草(‘绿洲’)的种子从北京克劳沃生态科技有限公司获得;选用的育苗基质购于一亩田农业科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1试验设计 本试验中3种草坪草的培养温度均为20℃～25℃;相对湿度为50%～60%;光照周期为12 h光照/12 h黑暗交替进行。Cd2+设置处理浓度为0,200,500,1 000,2 000 mg·kg-1,每个处理设置6个重复,将不同质量的氯化镉与基质混合均匀,装入无污染的花盆中(d=15 cm,h=11 cm),每种草坪草种植30盆,每2天浇一次水(不含Cd2+或肥料),浇水标准以达到田间持水量的75%～80%为准,浇水时确保无镉溶液渗漏,待60 d后测定其各项生理指标并观察叶片细胞超微结构。

1.2.2生理指标的测定 叶绿素含量采用乙醇-丙酮提取法[16]测定;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性采用氮蓝四唑法测定[17];过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性按张以顺等[18]的方法测定;过氧化氢(Catalase,CAT)活性按苍晶等[19]的方法测定;丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定[20]。

1.2.3叶片超显微结构观察 高羊茅和黑麦草选取Cd2+浓度为0,500,2 000 mg·kg-1成熟叶片进行切片观察,因白三叶在Cd2+浓度为2 000 mg·kg-1时死亡,故选取Cd2+浓度为1 000 mg·kg-1成熟叶片。在显微镜下切成6片1 mm×1 mm的叶块,参照郑敏娜等[21]的方法处理叶片组织,在HITACHI—H7500型投射电镜下观察拍照。

1.3 数据分析处理

试验数据采用SPSS 20.0软件最小显著差异法进行多重比较(P<0.05),数据处理用EXCEL 2007,作图使用Origin 2019。

2 结果与分析

2.1 Cd2+胁迫对草坪草光合色素的影响

3种草坪草的叶绿素含量随Cd2+浓度增加而降低(表1)。白三叶叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量及类胡萝卜素含量在Cd2+浓度为1 000 mg·kg-1时仅为对照的9%～18%,其差异达到极显著水平(P<0.01);其叶绿素b含量在Cd2+浓度200和500 mg·kg-1时为对照的55%和41%,差异显著(P<0.05);其总叶绿素含量和类胡萝卜素含量在Cd2+浓度500 mg·kg-1时分别为对照的57%和33%,差异显著(P<0.05)。

表1 不同浓度Cd2+对3种草坪草光合色素含量的影响

与对照相比,不同浓度Cd2+处理下高羊茅的叶绿素a和总叶绿素含量的差异达到极显著水平(P<0.01);其叶绿素b含量在Cd2+浓度200 mg·kg-1时为对照的60%,显著低于对照(P<0.05),在Cd2+浓度500～2 000 mg·kg-1时其叶绿素b含量较对照差异达极显著水平(P<0.01);其类胡萝卜素含量在Cd2+浓度为1 000 mg·kg-1时,较对照显著降低50%(P<0.05),在Cd2+浓度为2 000 mg·kg-1时较对照降低66%,差异达极显著水平(P<0.01)。

黑麦草叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量在Cd2+浓度1 000 mg·kg-1时为对照的57%～58%,显著低于对照(P<0.05),在Cd2+浓度2 000 mg·kg-1时为对照的31%～38%,差异达极显著水平(P<0.01),其类胡萝卜素含量在Cd2+浓度2 000 mg·kg-1时为对照的37%,其差异显著(P<0.05)。

2.2 Cd2+胁迫对草坪草抗氧化酶活性及MDA含量的影响

白三叶SOD活性随着Cd2+浓度增加而上升(图1A),在Cd2+浓度为500和1 000 mg·kg-1时分别较对照上升131%和162%,其差异达到极显著水平(P<0.01)。高羊茅的SOD活性在Cd2+浓度为1 000 mg·kg-1时SOD活性最高,与对照相比差异极显著(图1A,P<0.01),在Cd2+浓度为200和2 000 mg·kg-1时,SOD活性较对照显著上升42%和53%(P<0.05)。黑麦草的SOD活性随着Cd2+浓度增加表现出先升后降再升的趋势,其SOD活性在Cd2+浓度为200～2000 mg·kg-1时较对照升高106%和203%,其差异达极显著水平(图1A,P<0.01)。

图1 不同浓度Cd2+处理对3种草坪草抗氧化酶活性和MDA含量的影响

白三叶POD活性随着Cd2+浓度增加呈先升后降再升趋势(图1B),在Cd2+浓度为200和1 000 mg·kg-1时较对照升高75%和186%,其差异极显著(P<0.01)。高羊茅的POD活性随着Cd2+浓度增加而升高,在Cd2+浓度为500,1 000,2 000 mg·kg-1时分别为对照的2.6,3,3.9倍,其差异达极显著水平(图1B,P<0.01)。黑麦草的POD活性变化趋势与白三叶一致,均随着Cd2+浓度增加呈先升后降再升趋势,在Cd2+浓度为2 000 mg·kg-1较对照上升74%,其差异极显著(图1B,P<0.01)。

白三叶CAT活性随着Cd2+浓度增加而上升,在Cd2+浓度为200和500 mg·kg-1时与对照相比差异并不显著(图1C),在Cd2+浓度1 000 mg·kg-1时其CAT活性为对照的2.6倍,差异极显著(P<0.01)。高羊茅的CAT活性在Cd2+浓度为500 mg·kg-1时较对照降低54%,差异极显著(图1C,P<0.01),在Cd2+浓度为1 000 mg·kg-1时其CAT活性较对照升高94%,其差异达极显著水平(P<0.01)。黑麦草的CAT活性随着Cd2+浓度增加呈先升后降趋势,在Cd2+浓度为500和1 000 mg·kg-1时分别为对照的3.1倍和3.3倍,其差异极显著(图1C,P<0.01),当Cd2+浓度为200和2 000 mg·kg-1时差异并不显著,但均高于对照。

不同浓度Cd2+胁迫均会增加白三叶、高羊茅和黑麦草的MDA含量(图1D)。白三叶的MDA含量在Cd2+浓度200～1 000 mg·kg-1时其MDA含量为对照的5.6～6.3倍,其差异达到极显著水平(P<0.01)。高羊茅的MDA含量在Cd2+浓度为1 000～2 000 mg·kg-1时较对照显著上升28%～29%(P<0.05)。黑麦草的MDA含量在Cd2+浓度500～2000 mg·kg-1时与对照相比升高68%～108%,其差异极显著(P<0.01)。

2.3 Cd2+胁迫对草坪草叶片超微结构的影响

2.3.1Cd2+胁迫对白三叶叶片细胞超微结构的影响 白三叶叶肉细胞的各细胞器结构在对照中清晰(图2A,D,G,J,M);当Cd2+浓度为500 mg·kg-1时叶肉细胞中各细胞器没有出现变化(图2B,E,H,K,N);当Cd2+浓度为1 000 mg·kg-1时,叶绿体发生聚集、数量减少、形状变圆(图2C),叶绿体膜发生不同程度的溶解,叶绿体内部基粒片层结构混乱、排列不整齐、部分变为条纹状,质间片层空间变小、出现轻微质壁分离、部分溶解现象(图2F)。

图2 不同浓度Cd2+处理对白三叶叶片超微结构的影响

2.3.2Cd2+胁迫对高羊茅叶片细胞超微结构的影响 在对照中,高羊茅叶肉细胞的细胞壁、细胞核、液泡、叶绿体等细胞器结构清晰,叶绿体的形状为橄榄形或椭圆形,内部基粒片层结构明显且排列整齐、淀粉粒清晰可见(图3A,D,G,J,M)。在Cd2+浓度为500 mg·kg-1的处理下叶肉细胞没有出现变化(图3B,E,H,K,N);在Cd2+浓度2 000 mg·kg-1时,叶绿体发生聚集、数量减少(图3C),内部基粒片层结构被破坏,部分发生溶解断裂(图3F),细胞核内染色质发生轻微凝聚(图3L),细胞壁发生轻微质壁分离(图3O)。

图3 不同浓度Cd2+处理对高羊茅叶片超微结构的影响

2.3.3Cd2+胁迫对黑麦草叶片细胞超微结构的影响 黑麦草在对照中叶肉细胞的各细胞器结构清晰,叶绿体为椭圆形,内部基粒片层结构排列整齐、大部分为矩形、基粒类囊体片层垛叠紧密;当Cd2+浓度为500 mg·kg-1时其叶肉细胞内各细胞器没有出现变化(图4B,E,H,K,N);在Cd2+浓度为2 000 mg·kg-1时,叶绿体数量减少,发生聚集(图5C),内部片层结构模糊,基粒片层排列混乱且片层结构出现轻微溶解现象(图4F),细胞核内染色质略微凝聚(图4L),叶绿体和细胞壁的质壁分离现象明显,细胞壁轻微皱缩,液泡略微缩小(图4O)。

3 讨论

重金属胁迫对植物光合色素含量和叶绿体结构的影响,直接影响其生长发育及形态功能。造成叶绿素含量降低有两个原因,一是Cd与植物细胞中叶绿素合成酶相互作用,影响叶绿素前体合成,加快叶绿素分解[22];二是Cd破坏叶肉细胞内各细胞器的结构功能,从而降低叶绿素合成酶的活性[23]。本研究表明白三叶、高羊茅和黑麦草的叶绿素含量随Cd2+浓度增加而下降,与Huang等[24]在镉对高羊茅光合活性的研究结果一致。高浓度Cd2+胁迫降低高羊茅叶绿素含量,影响高羊茅正常生长。类胡萝卜素是重要的光合辅助色素,通过控制能量消耗和清除植物体内的自由基来避免蛋白质和叶绿素受到损伤[25],高浓度Cd2+胁迫下植物体内产生大量的自由基[26],超出抗氧化酶的清除能力,将会影响类胡萝卜素合成。本研究中3种草坪草的类胡萝卜素含量随着Cd2+浓度增加而降低的结论,与董春燕[27]以三叶草(Trifoliumpretense)为实验材料的研究结果类似,当镉浓度为3.5 mmol·L-1时类胡萝卜素含量较对照降低77.37%。

植物在逆境条件下会产生电子还原产物活性氧,其中包括超氧阴离子、过氧化氢等[28]。SOD酶能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢,POD酶的活性相对较高,CAT酶则能够催化过氧化氢分解成氧和水[29]。本研究中3种草坪草在镉胁迫下SOD和POD活性总体呈升高趋势,与Lou等[30]发现在Cd胁迫下高羊茅SOD和POD活性增加,以保护植物免受重金属诱导的氧化损伤的研究结论一致。抗氧化酶活性增加可将草坪草体内过多的活性氧自由基转化为毒害较低或无害物质,平衡活性氧含量,激活草坪草自身保护机制[6]。但是,当重金属浓度过高草坪草积累过量活性氧使细胞内蛋白质、核酸、色素和酶等受到氧化损伤[31],本研究中3种草坪草CAT活性随着Cd2+浓度增加呈先升后降趋势。韩宝贺等[32]研究结果中也有相同趋势,低浓度Cd2+胁迫下,白三叶升高CAT活性来防止活性氧造成的毒害,但在Cd2+浓度300 μmol·L-1时,植物体内的氧化平衡被打破,其CAT活性急剧下降。MDA含量通常用于判断植物细胞膜的损伤程度[33],其含量越高则表明对植物细胞膜的损伤越严重[34]。本研究中不同浓度的Cd2+胁迫均会增加草坪草的MDA含量,这与凌宇等[6]研究结果一致,在低、高浓度Cd2+胁迫下高羊茅和匍匐翦股颖(Agrostisstolonifera)MDA含量均高于对照。

植物细胞的超微结构变化规律是判断其抗逆能力的重要指标之一[33]。植物受到镉胁迫后其叶肉细胞内各细胞器的损伤主要体现在叶绿体、基粒片层、细胞壁、线粒体和细胞核等发生异常变化[24]。低浓度的Cd2+胁迫对草坪草叶片叶肉细胞超微结构的影响不明显,Cd2+浓度越高其各细胞器结构损伤越严重,主要表现为细胞壁发生质壁分离,叶绿体发生聚集、数量减少、形状改变、内部基粒片层结构被破坏。孙圆圆等[35]在镉胁迫对多花黑麦草(Loliummultiflorum)叶片超微结构的研究中也得出相似结论,高浓度Cd胁迫对多花黑麦草叶肉细胞超微结构有所损伤,部分叶绿体基粒片层溶解。综上,草坪草受到高浓度的Cd2+胁迫后产生过多的活性氧自由基,其体内将分泌大量的抗氧化酶来消除有害物质,超出抗氧化酶的清除能力,将引起膜脂过氧化反应从而产生大量的MDA,损伤草坪草细胞膜的结构,使其发生质壁分离,破坏叶绿体结构,进而降低光合色素含量,抑制光合作用,毒害草坪草的生理生化,最终影响草坪草进行正常的生命活动。

4 结论

随着Cd2+浓度增加,3种草坪草的生理损伤愈发严重,其光合色素含量不断减少,MDA含量逐渐增加,SOD和POD活性总体上为上升趋势,CAT活性呈先升后降趋势。其中,Cd2+浓度为2 000 mg·kg-1时,白三叶无法存活,高羊茅和黑麦草叶肉细胞内的细胞膜和各细胞器均受到不同程度的破坏,高羊茅叶绿体损伤更严重。因此,黑麦草的耐受能力高于高羊茅和白三叶,建议在镉污染较重的土壤选用高羊茅和黑麦草,镉污染较轻的土壤选用白三叶。