铁死亡在肿瘤免疫微环境中的研究进展

徐 喆，张 芳，姜 俊(空军军医大学：基础医学院学员一大队，西京医院呼吸与危重症医学科，空军卫勤训练基地卫生勤务教研室，陕西 西安 700)

铁死亡是铁依赖性的，由脂质过氧化产物累积引起的一种新型的非经典程序性细胞死亡形式，不同于传统的细胞凋亡、坏死和自噬死亡形式[1-2]。铁死亡的主要发生机制包括铁累积、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)活性降低、活性氧自由基及脂质过氧化物增多[3]。细胞内源性抗氧化防御铁死亡机制主要包括GPX4-谷胱甘肽(glutathione，GSH)[4]、FSP1-CoQH2[5-6]及二氢乳清酸脱氢酶(dihydroorotate dehydrogenase，DHODH)[7]信号通路。特异性抑制铁死亡防御机制、诱导肿瘤细胞铁死亡已经成为癌症治疗的一个全新的靶向策略[8]。目前有多种临床常规药物能够通过靶向铁死亡关键信号通路，如抑制Xc-或GPX4功能来促进肿瘤细胞铁死亡，例如肝癌靶向药索拉非尼[9]、炎症性肠病抗炎药柳氮磺嘧啶[10-11]。其他小分子抑制剂实验药物，如cyst(e)inase酶[12]、RAS选择性致死分子3(RAS-selective lethal 3，RSL3)[4]、Brequinar[7]可分别靶向胱氨酸或半胱氨酸、GPX4、DHODH铁死亡防御系统，促进铁死亡。

近年来，以免疫检查点抑制剂及免疫细胞过继疗法为主的肿瘤免疫治疗显著提高了肿瘤患者的生存率。然而，只有小部分肿瘤患者对免疫疗法有应答，研究认为，肿瘤细胞的低免疫原性以及免疫抑制微环境的存在限制了免疫疗法的抗肿瘤效应[13]。肿瘤微环境是一个复杂而动态的景观，主要由肿瘤细胞与浸润免疫细胞构成。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAM)、骨髓源性抑制细胞及调节性T(regulatory T，Treg)细胞增多和细胞毒性T细胞减少能够造成肿瘤细胞对免疫治疗耐受或无应答。而铁死亡作为肿瘤细胞死亡的一种重要方式，与肿瘤浸润免疫细胞存在多种联系。因此，本文主要阐述铁死亡在肿瘤免疫微环境中的作用，为铁死亡疗法在肿瘤免疫治疗中的联合应用提供可行性理论基础。

1 铁死亡在肿瘤免疫微环境中发挥双重作用

癌细胞中不稳定铁增加、脂质过氧化、活性氧异常堆积及氧化还原系统失衡等都可能加速铁死亡进程。铁死亡产生的代谢物与肿瘤免疫微环境中的各种免疫细胞与免疫分子存在多种相互作用，在肿瘤免疫中具有双重作用。

损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)是内源性细胞分子，在正常情况下参与不同的生理过程[14]。一旦肿瘤细胞受损或发生死亡，DAMP被释放并获得免疫原性，能够与模式识别受体结合，如Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)和嘌呤受体P2X7，促进炎症和先天免疫系统的激活[2]。DAMP起源于细胞膜和线粒体，是细胞外基质的产物。最常见的DAMP有三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)和钙网蛋白(calreticulin，CRT)，它们在免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death，ICD)中作为佐剂发挥着重要作用。这些分子分别与P2X7受体、TLR4或低密度脂蛋白受体相关蛋白1结合，通过激活免疫系统，增强抗肿瘤免疫效应[15]。

除了能够刺激肿瘤免疫外，有些DAMP分子却能发挥促肿瘤作用。如胰腺导管癌细胞发生铁死亡，释放KrasG12D到外泌体内，可被巨噬细胞摄取，促进M2型巨噬细胞极化与激活，促进肿瘤生长[16]。

2 CD8+ T细胞与铁死亡

2.1 CD8+ T细胞促进肿瘤细胞铁死亡

Xc-是一种胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白，主要功能为将胱氨酸导入细胞内，同时输出谷氨酸，参与GSH的生物合成，进而影响铁死亡。研究表明，免疫疗法激活的CD8+T细胞通过分泌γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)，可下调肿瘤细胞膜上Xc-的亚单位SLC7A11和SLC3A2的表达，增强肿瘤细胞内脂质过氧化，促使肿瘤细胞发生铁死亡、释放DAMP[17-18](图1)；DAMP进一步促进肿瘤内CD8+T细胞浸润，可提高免疫疗法的抗肿瘤疗效。对比使用PD-1抑制剂纳武利尤单抗的患者治疗前和治疗期间的转录组，分析显示SLC3A2的表达降低和IFN-γ、CD8的表达上调与临床患者疗效改善相关，这强调了CD8+T细胞具有促进肿瘤细胞铁死亡作用，提示靶向Xc-/GSH/GPX4通路与抗PD-1/PD-L1抗体结合可能是一种有效的肿瘤免疫联合治疗策略。

Glu：谷氨酸；Cys：半胱氨酸；GSH：谷胱甘肽；LPO：脂质过氧化物；HMGB1：高迁移率族蛋白1；IFN-γ：γ-干扰素；OxLDL：氧化低密度脂蛋白。图1 CD8+T细胞与铁死亡的联系

T细胞介导的肿瘤细胞铁死亡有助于抗PD-1/PD-L1抗体抑制肿瘤。有研究报道肿瘤细胞铁死亡受抑制也是PD-1/PD-L1抑制剂耐药的机制之一[19]。MIEN-CHIE HUNG团队研究在4T1乳腺癌小鼠模型中，TYRO3高表达上调SLC7A11、SLC3A2及GPX4，从而抑制乳腺癌细胞铁死亡，造成肿瘤对PD-1抑制剂耐药[19]。TCGA乳腺癌队列研究也验证了铁死亡相关SLC3A2蛋白与TYRO3表达呈正相关，TYRO3高表达与乳腺癌患者PD-1抑制剂耐药有关。

近日，邹伟平研究团队揭示了CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞的新机制，该研究提出花生四烯酸和CD8+T细胞分泌的IFN-γ可通过增强酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(Acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4)的表达，来促进肿瘤细胞铁死亡和提高抗肿瘤免疫效应[20]。ACSL4基因敲除小鼠模型证实，相对于ACSL4野生型，ACSL4敲除组能降低肿瘤内CD8+T细胞的浸润，降低IFN-γ和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的表达，减少瘤内脂质过氧化物水平，肿瘤体积显著增大。该研究不仅为CTL杀伤机制提供了新思路，也为诱导肿瘤细胞铁死亡、增强抗肿瘤免疫效应提供了新的联合策略。

2.2 铁死亡促进CD8+ T细胞耗竭

铁死亡不仅出现在肿瘤细胞中，免疫抑制肿瘤微环境中的浸润T细胞也可能发生铁死亡。CD8+T细胞耗竭与脂质摄取增加、胞内脂质过氧化堆积有关[21-22]。近期，崔国梁研究团队揭示了一种新的肿瘤免疫抑制机制[23]。肿瘤微环境产生大量的氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，OxLDL)，被高表达CD36(脂肪酸转运分子)的CD8+耗竭T细胞摄取，胞内脂质过氧化上调触发应激反应蛋白p38的激活及T细胞铁死亡，进而导致IFN-γ、TNF-α的表达下降，引起CD8+T细胞功能失调及抗肿瘤效应下降。并且该研究团队发现CD36表达与免疫检查点PD-1、TIM-3表达呈正相关，而过表达GPX4则能够抑制OxLDL引起的脂质过氧化，拯救T细胞免于铁死亡，挽救其抗肿瘤功能。

3 Treg细胞与铁死亡

Treg细胞是维持肿瘤细胞免疫耐受和逃逸的关键抑制性细胞。有研究报道，GPX4在抗肿瘤免疫中能防止Treg细胞发生脂质过氧化和铁死亡，从而维持其免疫抑制功能[24]。在T细胞受体/CD28共同刺激下，敲除GPX4能够引起Treg细胞内脂质过氧化物增多，引起Treg细胞发生铁死亡；而中和脂质过氧化物可挽救GPX4敲除的Treg细胞介导的铁死亡。另外，Treg细胞敲除GPX4增强白细胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)的分泌，促进Th17细胞介导的炎性反应，并可激活树突状细胞与CD8+T细胞功能。在MC38结肠癌及B16F10黑色素瘤动物模型中证实了特异性敲除Treg的GPX4表达会抑制肿瘤的生长。以上结果提示GPX4能维持Treg细胞内氧化还原平衡，可免其受脂质过氧化、铁死亡的影响，从而维持其免疫抑制功能，揭示了诱导Treg细胞铁死亡可成为改善癌症治疗的有效策略。

4 TAM与铁死亡

TAM是肿瘤微环境中的主要免疫细胞，其浸润程度与患者预后不良有关[25]。在大多数肿瘤中，表达Arg-1、CD206为特征的M2型抗炎促肿瘤TAM主要通过产生IL-10和转化生长因子β，促进血管生成、基质重塑和免疫抑制来维持肿瘤细胞生长；而表达CD86、iNOS的M1型促炎抗肿瘤TAM主要通过IL-1α/β、IL-6、TNF-α及活性氧来限制肿瘤的发生与进展[26]。

4.1 M1、M2型巨噬细胞对铁死亡敏感性不同

有研究表明，巨噬细胞对铁死亡诱导剂表现出不同的敏感性[27]。高表达iNOS的促炎M1型巨噬细胞对铁死亡耐受；然而M2型巨噬细胞对铁死亡相对敏感。NO能够抑制M1型巨噬细胞中15-脂氧化酶催化的多不饱和脂肪酸过氧化作用，从而阻止M1型巨噬细胞发生铁死亡(图2)。因此，铁死亡诱导剂(GXP4抑制剂RSL3)不能诱导高表达iNOS的M1型巨噬细胞发生铁死亡，却能够杀死促肿瘤的M2型巨噬细胞，从而消除其免疫抑制作用，发挥抗肿瘤协同效应。

DC：树突状细胞；iNOS：诱导型一氧化氮合酶；PD-1：程序性死亡受体1；LPO：脂质过氧化物；Glu：谷氨酸；Cys：半胱氨酸；GSH：谷胱甘肽；HMGB1：高迁移率族蛋白1。图2 铁死亡调节骨髓系免疫细胞的分化与成熟

4.2 肿瘤细胞铁死亡促进M2型巨噬细胞极化

肿瘤细胞铁死亡除了能够释放经典的ATP、HMGB1和CRT等DAMP，还能释放其他DAMP分子，如KrasG12D和8-羟基鸟苷。这些分子可影响肿瘤微环境中固有免疫细胞(如巨噬细胞)的功能。例如，自噬依赖的铁死亡能够通过AGER/RAGE途径和STAT3依赖的脂肪酸氧化作用来调节TAM的极化与激活。胰腺导管腺癌细胞释放KrasG12D，被巨噬细胞吸收并使其本身向促肿瘤的M2型巨噬细胞表型转化[16]。

此外，有研究报道高铁饮食或GPX4消耗，均可促进8-羟基鸟苷(DNA损伤的主要产物)的释放，从而激活TMEM173/STING信号通路，引起TAM迁移和活化，促进Kras驱动的胰腺导管癌的发生[28]。高铁饮食或GPX4消耗可引起胰腺腺泡上皮细胞化生及上皮内瘤变。TAM在Kras驱动的小鼠中随着GPX4消耗或高铁饮食而增加；氯磷酸盐脂质体消耗TAM后，小鼠胰腺癌变及死亡率相对减轻，以上结果提示铁死亡相关分子是胰腺肿瘤微环境中TAM浸润和活化的重要调节因子。

5 骨髓源性抑制细胞与铁死亡

骨髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)是肿瘤微环境中抑制T细胞功能的主要免疫抑制细胞类型之一[29]。而关于MDSC的铁死亡机制研究报道较少。LIU KEBIN课题组发现N-酰基鞘氨醇酰胺酶(N-acylsphingosine amidohydrolase，ASAH2)在结肠癌的MDSC中高表达。ASAH2在肿瘤微环境中通过降低p53稳定性，上调Hmox1的表达，抑制脂质活性氧的产生，从而减少MDSC铁死亡[30]。NC06作为ASAH2抑制剂，抑制神经酰胺酶的活性，可以诱导MDSC铁死亡。动物模型证实了NC06通过促进MDSC铁死亡抑制MDSC在移植瘤内的浸润，抑制肿瘤生长。因而，用NC06靶向ASAH2诱导MDSC铁死亡，有可能是免疫治疗抑制瘤内MDSC浸润的有效途径。

6 树突状细胞与铁死亡

早期肿瘤细胞铁死亡能够促进树突状细胞成熟与激活，提升其抗原提呈作用，进而刺激效应T细胞发挥抗肿瘤效应[31]。EFIMOVA等[32]在动物模型中发现了GPX4抑制剂RSL3引发肿瘤细胞发生ICD来激活树突状细胞，进而诱导抗肿瘤免疫的新机制。该作者首先证实RSL3通过铁死亡，而不是凋亡和坏死，诱导小鼠纤维肉瘤MCA205细胞死亡，并比较RSL3处理MCA205细胞1 h(早期肿瘤细胞铁死亡)和24 h(晚期肿瘤细胞铁死亡)对小鼠骨髓来源树突状细胞(bone-marrow derived dendritic cell，BMDC)成熟的影响。结果显示肿瘤细胞早期铁死亡能够诱导BMDC的成熟，而晚期的铁死亡肿瘤细胞被BMDC介导的吞噬作用所消除。随后，在免疫功能正常的C57BL/6J小鼠上皮下接种早期或晚期铁死亡MCA205细胞，在第7日注射正常MCA205细胞，发现早期注射过的铁死亡癌细胞能够减弱正常MCA205细胞的增殖，提示早期铁死亡癌细胞能够刺激机体产生抗肿瘤效应。用oxiATP对ATP受体(P2X7)进行药物阻断，可以逆转早期铁死亡癌细胞接种的抗肿瘤保护作用，提示ATP是早期铁死亡癌细胞引起的ICD所必需的。

7 铁死亡与免疫治疗

肿瘤细胞铁死亡能够加强肿瘤微环境中抗肿瘤反应，因此诱导肿瘤细胞铁死亡与免疫疗法联合的治疗策略在癌症治疗中具有良好的应用前景。既往研究发现，在单独使用PD-L1阻断剂或Cyst(e)inase酶的小鼠中，肿瘤细胞生长相对降低，但在联合使用PD-L1阻断剂或Cyst(e)inase酶的小鼠中，肿瘤生长受到强烈抑制[17]。联合治疗显著增加肿瘤细胞内的脂质过氧化作用，提高了IFN-γ、TNF-α、CD8+T及CD4+T细胞的比例，增加了免疫细胞的抗肿瘤作用。然而近期有学者报道，在黑色素瘤PD-1抑制剂治疗过程中，虽然肿瘤细胞的Xc-功能受抑制，却能通过分泌含有高水平的PD-1外泌体，刺激M2型巨噬细胞极化，从而对PD-1抑制剂产生抵抗耐药特性[33]。因此，抑制肿瘤细胞内高水平的PD-1外泌体的产生，是解决该耐药问题的关键。

通过纳米递药系统将铁死亡诱导剂及外泌体抑制剂导入肿瘤微环境中，促进肿瘤细胞发生铁死亡并且恢复T细胞功能，成为增强肿瘤免疫疗法的新型治疗策略。代云路课题组通过构建GW4869外泌体抑制剂和Fe3+铁死亡诱导剂偶联的HGF纳米单元，抑制B16F10黑色素瘤细胞分泌外泌体，能够间接抑制PD-L1的表达，恢复CD8+T的功能，促进IFN-γ的分泌；IFN-γ则能够降低肿瘤细胞膜表面SLC7A11和SLC3A2的表达，破坏肿瘤细胞的抗氧化系统，诱导肿瘤细胞铁死亡[34]。

8 结束语

肿瘤细胞铁死亡可引起胞内DAMP的释放，在抗肿瘤免疫中具有双重作用。一方面DAMP诱发ICD，增强树突状细胞及CD8+T细胞抗肿瘤功能，同时CD8+T细胞反过来又可以通过分泌IFN-γ来促进肿瘤细胞铁死亡的发生；另一方面，肿瘤细胞释放特殊的DAMP，以及分泌含有高水平PD-1的外泌体，刺激TAM向M2型抗炎促肿瘤表型转化，从而促进肿瘤发生与进展。除了肿瘤细胞能够发生铁死亡影响免疫应答，微环境中的免疫细胞也可能发生铁死亡，是免疫治疗耐药抵抗的机制之一。例如，耗竭T细胞高表达CD36可促进胞内氧化脂质体增多，引起T细胞铁死亡，产生免疫治疗抵抗；另外，不同分型巨噬细胞由于能量代谢不同，对铁死亡耐受性不同，例如M1型巨噬细胞由于高表达iNOS而免于铁死亡。因而通过对巨噬细胞能量代谢进行重编组，可促进M2型巨噬细胞发生铁死亡或促进M1型巨噬细胞极化与激活，从而提高肿瘤免疫治疗的疗效。

综上所述，铁死亡与肿瘤微环境错综复杂的联系影响到免疫治疗的疗效。诱导肿瘤细胞、免疫抑制细胞(M2型巨噬细胞、Treg细胞及MDSC)发生铁死亡，以及减少CD8+T细胞铁死亡是有效的治疗策略，可减少免疫检查点抑制剂耐药的发生。同时，免疫疗法联合针对铁死亡信号的药物可以协同增强免疫治疗的效果，并有望通过纳米递药系统实现高效低毒的抗肿瘤效应。