紫甘蓝中多酚提取工艺及抗氧化研究

张潇,周海旭,高晗,贾亚茹

（1.河南科技学院食品学院,河南 新乡 453003；2.漯河食品职业学院,河南 漯河 462300）

紫甘蓝又称紫卷心菜,属十字花科（Cmciferae）,具有色彩靓丽、营养丰富、生长期短、产量大、适应性强等优点,世界各地均有种植[1].但因其含水量高、贮存期短、易腐烂变质而造成资源浪费.研究表明,紫甘蓝中含有大量的多酚类物质,主要包括单宁、儿茶酚、原花青素、没食子酸、类黄酮和多巴酚等成分[2],具有减缓衰老、抗肿瘤、解酒护肝、抗炎等功效[3-5],现已被广泛应用于食品、化妆品、化工等领域[6-7].

目前,多酚提取方法有溶剂提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法等.传统的溶剂提取法具有易操作、耗时长、效率低、占资源等特点[8].微波辅助提取法能迅速穿透萃取介质转化为热能,使细胞内部温度快速上升,细胞内部压力超过耐受力而破裂,有效成分随即流出.但与传统溶剂提取法相比,其具有易操作、受热均匀、节能省时等优点.不过微波处理易导致热敏感性物质变性或失活,另外设备如果有泄漏将造成人体慢性损伤[9].超声波辅助提取法是在机械、空化及热效应作用下,促进组织细胞分裂,细胞壁破坏使细胞内物质完全释放,可有效提高多酚提取率.此方法具有操作简便、耗时短、损耗小、提取率高[10]等优点.曹叶霞[11]采用超声波辅助提取法从罗望子中提取总多酚，提取率为1.57%.采用超声波辅助法提取紫甘蓝中的多酚未见报道.因此,本文以紫甘蓝为原料,在单因素基础上采用正交试验优化超声波辅助法提取多酚工艺,对其抗氧化活性进行初步研究,以期为紫甘蓝中多酚的综合利用提供理论参考.

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料紫甘蓝购于新乡市世纪华联超市；没食子酸、无水乙醇、福林酚、95%乙醇、DPPH 干粉、FeSO4粉末、H2O2溶液来自天津市科密欧化学试剂有限公司,均为AR.

1.1.2 主要设备S-JB21F 型搅拌机,安徽合肥荣事达有限公司；722 可见分光光度计,北京台丝特科技有限公司；H165KR 型高速冷冻离心机,长沙翔宇科技有限公司；HB-W410 型电子恒温水浴锅,郑州明途机械有限公司；UF2020 型分析天平,上海市圣汇仪器有限公司；DKG201-0 型电热恒温鼓风干燥箱,浙江绍兴恒幸仪器有限公司；YSE-501 型旋转蒸发器,广东玉华仪器有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 原材料加工工艺紫甘蓝→清洗→剥叶→65 ℃烘干→粉碎→过筛（80 目）备用.

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 最佳乙醇料液比的确定在原材料加工工艺的基础上,保持体积分数为50%乙醇溶液,超声时间20 min,固定其他条件不变,选取料水比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL,通过多酚提取量测定分析,确定最佳乙醇料液比.

1.2.2.2 最佳超声时间的确定在原材料加工工艺的基础上,保持乙醇溶液料液比1∶30 mL,超声时间20 min,其他条件固定不变,选取乙醇体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%,通过多酚提取量测定分析,确定最佳乙醇体积分数.

1.2.2.3 最佳超声时间的确定在原材料加工工艺的基础上,保持乙醇溶液料液比1∶30 mL,乙醇体积分数65%,其他条件固定不变,选取超声时间分别为10、20、30、40、50 min 通过多酚提取量测定分析,确定最佳超声时间.

1.2.3 正交试验优化在单因素基础上设置合理的参数,分别选取料液比、乙醇体积分数、超声时间3 个因素,各因素进行3 水平即L9（33）正交试验,由多酚提取量确定紫甘蓝中多酚提取最佳提取工艺.

1.2.4 标准曲线的制作参照文献[12]方法略作修改,称取没食子酸0.2 g,定容至100 mL,吸取1 mL 稀释至100 mL,分别量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于容量瓶中,依次加入福林酚试剂2 mL,静置反应3 min,加入2 mL 碳酸钠（10%）,室温下静置1 h,蒸馏水定容至10 mL,制得没食子酸含量分别为2、4、6、8、10 mg/L的溶液.用同法来配制所需空白试剂,测吸光值,对应波长为760 nm.以吸光值为（y）、没食子酸溶液质量浓度为（x）绘制标准曲线.

1.2.5 紫甘蓝中多酚提取量的测定取0.5 g 紫甘蓝粉末加入乙醇溶液,进行超声波处理,控制不同的单因素条件提取多酚.提取液4 000 r/min,15 min 离心取上清液,记录其体积.将样液稀释100 倍,加入2 mL福林酚试剂,静置反应3 min,加入2 mL 10%的Na2CO3溶液,室温避光静置1 h,蒸馏水定容至10 mL,混匀后测定吸光值,波长为760 nm,记录测定结果.

1.2.6 样品多酚类物质提取量的计算

式（1）中：C/mg 为待测液中多酚类物质的含量；V/mL 为提取液体积；N 为稀释倍数；W/g 为样品的质量.

1.2.7 DPPH·清除能力的测定根据参考文献[13]略作修改.取2 mL 不同质量浓度的多酚提取液,加入2 mL DPPH（0.2 mmol/L）混合后,置于室温避光的条件下反应30 min,波长为517 nm,测定吸光值,同时用VC做阳性对照.

根据式（2）计算,并绘制所需曲线

式（2）中：A1为样品吸光值,A2为样品本底吸光值,A0为空白对照吸光值.

1.2.8 OH 清除能力的测定测定方法根据参考文献[14]略作修改.取2 mL 质量浓度不同的多酚溶液,依次加入2 mL FeSO2（0.45 mmol/L）溶液,2 mL H2O2（4.4 mmol/L）溶液,静置反应10 min,加入2 mL 水杨酸-乙醇（4.5 mmol/L）溶液,置于37 ℃的水浴中放置30 min；波长为510 nm,测定吸光值,用VC做阳性对照.

式（3）中：A1为样品吸光值,A2为样品本底吸光值,A0为空白对照吸光值.

1.3 数据分析

采用Excel 2007 和orgin 6.0 对数据进行分析,每组试验重复3 次,确保结果有效性.

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

福林酚试剂氧化多酚中的-OH 基团并使其显蓝色,蓝色的深浅与多酚的含量成正相关[15].如图1 所示,得到没食子酸含量在2～10 μg 范围内的标准曲线方程为：y=0.084 7x+0.031 8,R2=0.999 6,说明该模型具有良好的线性关系,其中x/μg 为没食子酸含量,y 为吸光度.

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Gallic acid standard curve

2.2 料液比对紫甘蓝中多酚类物质提取量的影响

如图2 所示,多酚在溶液中的质量浓度差异主要来源于料液比的影响,质量浓度差异越大,提取的推动力越强,萃取速度越快.

图2 不同料液比对紫甘蓝中多酚提取量的影响Fig.2 Effects of different ratios of solid and liquid on the extraction amount of polyphenol in Purple Cabbage

由图2 可以看出,当料液比在1∶10～1∶30 g/mL 范围内多酚提取量逐步呈现先增加后降低的变化趋势,料液比为1∶25 g/mL 时多酚含量最高.

2.3 乙醇体积分数对紫甘蓝中多酚提取量的影响

如图3 所示,植物内所含的大量多酚羟基极性较强,多酚以氢键的形式与细胞内其他化合物相结合[16].

图3 乙醇体积分数对紫甘蓝中多酚提取量的影响Fig.3 Effects of ethanol volume fractions on the extraction amount of polyphenol from Purple Cabbage

由图3 可以看出,根据相似相溶原理,乙醇体积分数对紫甘蓝中多酚的溶解具有较强的促进作用[17].乙醇体积分数在30%～70%范围内,紫甘蓝中多酚提取量呈现出先增加后降低的变化趋势,当乙醇体积分数为60%时,其多酚含量最高.

2.4 超声时间对紫甘蓝中多酚提取量的影响

如图4 所示,在超声波机械、空化及热效应下,促进了组织和细胞分裂,细胞壁破坏使细胞内物质完全释放[18].如图4 可以看出,超声时间在10～50 min 范围内,紫甘蓝中多酚提取量呈现先增加后降低趋势,当超声时间为20 min 时,其多酚含量达到最高值.

图4 超声时间对紫甘蓝多酚提取量的影响Fig.4 Effects of ultrasonic time on the extraction Amount of polyphenol from Purple Cabbage

2.5 正交试验优化提取条件

为获得香菇多糖提取的最佳工艺条件,在上述探索性试验的基础上,选用3 因素3 水平L9（33）正交试验,考察超声时间、乙醇体积分数、料液比对香菇多糖提取率的影响,筛选出所需的最佳提取组合.正交试验因素水平,如表1 所示.

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Level table of orthogonal experimental factors

由表1、2 可知,各因素对紫甘蓝多酚提取率的影响具有一定差异,根据极差Ri可判断影响紫甘蓝多酚提取量的因素顺序为A＞C＞B,即影响样品中紫甘蓝中多酚提取率的主要因素是超声时间,可以得出最优组合为A3B3C3,即当超声时间为25 min,乙醇体积分数为65%,料液比为1∶30 g/mL 时,紫甘蓝多酚提取量最大.

2.6 最优组合的验证

为验证紫甘蓝中多酚提取最优组合A3B3C3,对该组合进行5 次平行试验验证,试验结果分别为18.81%、18.86%、18.73%、18.78%、18.70%,平均值为18.776%,表2 中的提取值基本一致,表明该组合为最优组合.

表2 正交试验的数据与分析Tab.2 Data and analysis of orthogonal experiment

2.7 紫甘蓝多酚的抗氧化活性研究

2.7.1 DPPH·自由基清除能力的测定多酚与DPPH·自由基中的单一电子配对,DPPH·醇溶液在517 nm条件下有吸收峰,其颜色变化程度与多糖的质量浓度呈正相关性[19],如图5 所示.

图5 紫甘蓝多酚类物质对DPPH·的清除能力Fig.5 DPPH·scavenging activity of polyphenols in Purple cabbage

由图5 可以看出,样液质量浓度在20～100 μg/mL 范围内,对DPPH·清除率呈现先升高后降低的变化趋势,当质量浓度为60 μg/mL 时,清除率达到90.64%.

2.7.2·OH 清除能力的测定·OH 自由基是探究抗氧化活性的一个重要指标,它是一种活性极强的自由基,通过紫甘蓝中多酚类物质清除自由基的能力,可判断其是否具有抗氧化活性,如图6 所示.

图6 紫甘蓝多酚类物质对·OH 的清除能力Fig.6 Scavenging ability of purple cabbage polyphenols on·OH

由图6 可以看出,质量浓度在50～300 μg/mL 范围内呈现逐步升高的变化趋势,紫甘蓝中多酚比对照物VC具有更强的清除作用,并高于同等质量浓度下VC对·OH 的清除能力.当紫甘蓝中多酚质量浓度为300 μg/mL 时,清除率达到75.21%.

3 小结

本研究以紫甘蓝为材料,通过单因素结合正交试验,在超声波辅助条件下,以超声时间、乙醇体积分数、料液比为影响因素,对紫甘蓝中多酚类物质提取工艺及抗氧化活性进行了研究,每组试验进行三次重复.

提取工艺优化结果表明：①当料液比为1∶30 g/mL,乙醇体积分数为65%,超声时间为25 min 时,提取效果最佳,多酚提取量可达18.78 mg/g.在三个因素中超声时间对多酚提取率的影响最大,其次是料液比,次之为乙醇体积分数.②抗氧化试验表明：紫甘蓝中多酚类物质具有较强的抗氧化能力,当多酚质量浓度为60 μg/mL 时,对DPPH·的清除率达到了90.64%；当多酚质量浓度为300 μg/mL 时,对·OH 清除率达到75.21%.