FOXQ1 敲除乳腺癌MCF7 细胞株的构建及其功能初探

杨欢，冯玉梅

（天津医科大学肿瘤医院肿瘤研究所生物化学与分子生物学研究室；国家肿瘤临床医学研究中心；天津市“肿瘤防治”重点实验室；天津市恶性肿瘤临床医学研究中心；乳腺癌防治教育部重点实验室，天津 300060）

缺氧微环境是实体瘤的普遍特征。Voss 等[1]研究发现，缺氧环境可导致乳腺癌细胞迁移能力的增加。此外，多个研究表明，原发性肿瘤氧合不良的患者转移率和死亡率增加[2-4]。缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）是体内多器官系统中细胞缺氧反应的主要转录因子和调节因子[5]。在常氧环境中HIF-1α 的脯氨酸残基发生羟基化使其被泛素化降解，而缺氧环境中HIF-1α 脯氨酸不再发生羟基化，从而导致HIF-1α 蛋白的积累[6]。

叉头框（forkhead box，FOX）蛋白是在进化上保守的转录因子超家族，在癌症的发生、发展中发挥重要作用[7]。许多FOX 蛋白被报道直接或间接响应缺氧信号而被激活表达[8-11]。FOXQ1 是FOX 转录因子家族成员之一，其在包括乳腺癌在内的多个癌种中被表征为上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的主要激活剂，赋予细胞转移和侵袭的能力[12-15]；并且其在间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）中被报道可能间接响应于缺氧信号而表达上调[11]。因此推测，在乳腺癌中，处于缺氧微环境的癌细胞其可能响应于缺氧信号导致FOXQ1 表达上调，从而产生具备较高转移或侵袭能力的亚克隆。

为了构建有效的实验模型，选择通过成簇的规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）系统来构建FOXQ1 基因敲除的MCF7 细胞株。该系统由Cas9 蛋白、CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）组成。其中，crRNA 作为识别模块能够识别相应的特异性靶序列；tracrRNA 和crRNA 的核苷酸链能互补配对构成单指导RNA（single guide RNA，sgRNA），sgRNA 与Cas9 一同形成核糖核蛋白复合物（ribonucleoprotein，RNP）并同时激活Cas9 作为核酸内切酶的功能[16-17]；Cas9 切断目的区域的双链核酸，诱导细胞内源DNA 损伤修复机制工作，最终借助该机制达到编辑遗传信息的目的[18]。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人乳腺癌细胞系MCF7 来自American Type Culture Collection；DMEM 高糖培养基、胎牛血清和青霉素/链霉素购于美国Gibco 公司；Leti-CAS9-puro 单载体慢病毒购于吉凯基因；crRNA 和tracrRNA 由广州锐博生物合成；Lipofectamine 3000转染试剂购于美国Invitrogen；T7 核酸内切酶I（T7 Endonuclease I，T7E1）和NE Buffer 购于美国NEB 公司；DNA 提取试剂盒、DNA 纯化试剂盒、PrimeSTAR Max DNA Polymerase 均购于日本Takara 公司；FOXQ1 抗体购于美国Santa 公司；HIF-1α 抗体购于美国CST 公司；β-Actin 抗体购于武汉ABclonal 公司；transwell 购于美国Corning 公司；结晶紫染液购于上海碧云天公司。

1.2 实验方法

1.2.1 crRNA 设计合成 从NCBI 中检索人FOXQ1 基因的外显子序列，根据Cas9 靶点设计原则，即待编辑的区域附近存在相对保守的PAM 序列（NGG），并针对其外显子碱基序列设计3 个敲除位点（表1）。根据敲除位点设计合成相应的crRNA以及与之配套的tracrRNA，KO#1、KO#2 和KO#3 3个敲除位点对应的crRNA 分别命名为FOXQ1-crRNA#1、FOXQ1-crRNA#2 和FOXQ1-crRNA#3。

表1 敲除位点识别序列Tab 1 Knockout site recognition sequences

1.2.2 构建Cas9 工具细胞株 将1×105个MCF7细胞接种于24 孔板，待细胞融合度达到约30%时，加入2 μL Leti-CAS9-puro 慢病毒。细胞感染12 h观察细胞状态，如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24 h 后弃去含有病毒的培养基，更换为新鲜DMEM 完全培养基。感染2 d 后更换培养基为含2 μg/mL 嘌呤霉素的DMEM 完全培养基进行连续3 d 的药物筛选，由此获得Cas9 稳定表达MCF7细胞株，作为MCF7-Cas9 工具细胞待用。

1.2.3 转染FOXQ1-crRNA+tracrRNA 接种1×105个MCF7-Cas9 工具细胞于24 孔板，待细胞融合度达到50%~70%时进行FOXQ1-crRNA+tracrRNA的转染。取一支1.5 mL EP 管，加入25 μL Opti-MEM减血清培养基，再分别加入2 μL FOXQ1-crRNA和EP 管，加入25 μL Opti-MEM 减血清培养基，再加入3 μL lipo3000 转染试剂；而后将FOXQ1-cr－RNA+tracrRNA、Opti-MEM 混合物加入到Opti-MEM 减血清培养基稀释的lipo3000 转染试剂中，室温孵育5 min。孵育结束后，将上述制备好的转染混合物加入到细胞培养基中，于37℃、5%CO2条件下培养，48 h 后更换新鲜DMEM 完全培养基，并继续扩增培养，供后续实验使用。

1.2.4 T7EI 酶切检测靶位点编辑效率 目的基因片段经PCR 扩增后重新变性退火变成异源双链DNA，T7EI 酶能够识别不完全匹配的双链DNA，从不匹配的位置将其酶切，利用这个性质能够鉴定CRISPR/Cas9 编辑形成的突变体，评估crRNA 的编辑效率。转染FOXQ1-crRNA+tracrRNA 的MCF7-Cas9 细胞扩至12 孔板后，取一半细胞按试剂盒步骤提取基因组DNA，并用微量紫外分光光度计定量。PCR：吸取50 ng 基因组DNA 用PrimeSTAR Max DNA Polymerase 进行PCR 扩增，扩增出含crRNA靶序列的片段，其引物信息见表2；PCR 产物用DNA纯化试剂盒进行纯化，并用微量紫外分光光度计进行定量。PCR 产物变性退火：取200 ng 纯化后的PCR产物，加入2 μL NE Buffer，并补充无核酸水至19 μL，并根据T7E1 试剂盒提供的变温条件进行变性退火。T7EI 酶切：向退火后的PCR 产物加入1 μL T7EI酶，于37℃孵育15 min，加入1 μL 的proteinase K，37℃温育5 min 终止酶切。2%的琼脂糖凝胶电泳检测退火后的PCR 产物的酶切效率，酶切率越高则细胞靶位点编辑效率越高。

表2 引物序列Tab 2 Primer sequences

1.2.5 FOXQ1 基因敲除单克隆细胞株的筛选 用1.2.4 中筛选出的靶位点编辑效率较高的细胞消化后计数，计数后按1 cell/孔的量接种按至96 孔板进行培养，12 h 内于镜下观察，舍去多细胞孔，单细胞孔继续扩增培养；待单克隆细胞扩至12 孔板取一半细胞提取基因组DNA，再次用T7EI 酶鉴定单克隆细胞靶基因的编辑状态，实验方法同1.2.4。将有酶切效率的PCR 产物送至生工生物工程公司进行Sanger 测序，从DNA 水平鉴定FOXQ1 的敲除情况；根据DNA 测序结果筛选出FOXQ1 基因稳定敲除的MCF7 单克隆细胞株。而后，通过Western 印迹从蛋白水平进一步鉴定FOXQ1 的敲除。

1.2.6 Western 印迹 将细胞种于6 孔板，待细胞长满后加入适量细胞裂解液提取总蛋白，用BCA 法测定细胞蛋白浓度；各取40 μg 蛋白，用10%的SDS-PAGE 凝胶进行电泳，80 V 30 min，100 V 90 min；转膜，80 V 120 min；5%脱脂牛奶室温封闭1 h；分别加入一抗FOXQ1（1∶1 000）、HIF1-α（1∶1 000）和β-Actin（1∶5 000）4℃孵育过夜；次日TBST洗膜后加入对应的二抗（1∶2 000），室温孵育1 h后TBST洗膜，加入ECL 试剂化学显色。

1.2.7 划痕实验 将MCF7-FOXQ1-/-1 和MCF7-FOXQ1-/+2 及其野生对照MCF7-WT 细胞均匀接种于6 孔板中，待细胞融合度达到100%，用枪头在每个孔内划出2×2 横竖交叉的4 条线，PBS 清洗脱落细胞，更换新鲜DMEM 培养基，镜下拍照，记为0 h；常氧组和缺氧组分别置于20%O2和1%O2条件下培养，往后每12 h 拍照记录一次，并测量划痕间距；划痕愈合率=（0 h 划痕间距-培养后划痕间距）/0 h划痕间距×100%。

1.2.8 transwell 实验 于24 孔板中加入750 μL 含20%血清的DMEM 培养基，并将transwell 小室置于孔中；分别设置常氧（20%O2）和缺氧（1%O2）组，每组取生长状态良好的MCF7-FOXQ1-/-1 和MCF7-FOXQ1-/+2 细胞及其野生对照MCF7-WT 细胞各5×104个，重悬于500 μL DMEM 培养基中并接种于小室内，每个细胞设3 个重复。48 h 后取出小室，用棉签轻轻擦拭小室内部去除未发生迁移的细胞，4%多聚甲醛室温固定30 min，结晶紫室温染色30 min，PBS 清洗后置于室温风干。显微镜观察染色细胞，随机选取5 个视野拍照并统计细胞数。

1.2.9 生物信息学分析 从METABRIC 数据库中下载并整理了1 980 例乳腺癌患者的RNA-seq 数据，用于分析FOXQ1 与缺氧相关基因的表达相关性。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0 软件进行数据分析和作图。数据符合正态分布，采用单因素方差分析和t 检验进行差异分析，采用Pearson 相关性分析评估基因间mRNA 表达的相关性。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FOXQ1 基因敲除单克隆细胞株的获取 转染FOXQ1-crRNA+tracrRNA 的MCF7-Cas9 细 胞 经T7E1 酶切检测出FOXQ1-crRNA#3 对细胞靶位点有最高的编辑效率。用该细胞进行单克隆培养后经T7E1 酶切验证出4 株有靶基因编辑效率的单克隆细胞（图1A）。通过进一步比对sanger 测序结果，从4 株有FOXQ1 基因编辑效率的单克隆细胞中鉴定出一株纯合子细胞和3 株杂合子细胞，依次命 名 为 MCF7 -FOXQ1-/-1、MCF7 -FOXQ1-/+2、MCF7-FOXQ1-/+3 和MCF7-FOXQ1-/+4。纯合子细胞株测序结果显示，与野生型MCF7 相比，其缺失了包括FOXQ1-crRNA#3 识别区域在内的57 个碱基，并在缺失序列后的第10 个碱基位点发生G-A 碱基突变（图1B）。

图1 FOXQ1 基因敲除单克隆细胞株的获取Fig 1 Acquisition of FOXQ1 gene knock out monoclonal cell lines

2.2 FOXQ1 基因敲除细胞株的蛋白表达验证 尽管基因移码突变对翻译过程有极大影响，但此4 株FOXQ1 敲除的细胞株中FOXQ1 蛋白的表达是否确切受到影响还需进一步验证。Western 印迹结果显示，与野生型MCF7-WT 细胞相比，纯合子MCF7-FOXQ1-/-1 和杂合子MCF7-FOXQ1-/+2 细胞株已完全不表达FOXQ1 蛋白，而杂合子MCF7-FOXQ1-/+3和MCF7-FOXQ1-/+4 还能检测到一部分FOXQ1 蛋白的表达。理论上，基因敲除的杂合子细胞对基因的编辑效率应为50%，但FOXQ1在MCF7 细胞中本身是低表达或不表达的，因此MCF7-FOXQ1-/+2 可能是一个FOXQ1 本底表达足够低的单克隆。所以，成功构建了两个FOXQ1 基因稳定敲除的MCF7 细胞，即纯合子MCF7-FOXQ1-/-1 和杂合子MCF7-FOXQ1-/+2 细胞株，故后续实验选取此两株进行（图2）。

图2 FOXQ1 基因敲除细胞株的蛋白表达验证Fig 2 Verification of protein expression in FOXQ1 knockout cell lines

2.3 缺氧促进MCF7 细胞中FOXQ1 的表达 Western印迹结果显示，与常氧相比，缺氧环境中，MCF7-WT细胞FOXQ1 蛋白表达显著上调。相应的，FOXQ1 敲除杂合子细胞MCF7-FOXQ1-/+2 也显示出部分FOXQ1 蛋白的上调（图3）。

图3 缺氧促进MCF7 细胞中FOXQ1 的表达Fig 3 Hypoxia promotes FOXQ1 expression in MCF7 cells

2.4 FOXQ1 介导缺氧引起的MCF7 细胞迁移能力的增加 划痕实验和transwell 实验结果显示，与常氧相比，缺氧显著上调MCF7-WT 的转移能力（t=3.78，P<0.01；t=11.94，P<0.001），而FOXQ1 敲除的纯合子细胞MCF7-FOXQ1-/-1 在缺氧条件下的转移能力基本与常氧条件下持平（t=0.63，P=0.55；t=2.54，P=0.06）。相应的，FOXQ1 敲除的杂合子细胞MCF7-FOXQ1-/+2 其在缺氧条件下的转移能力有一定程度的上调（t=2.46，P<0.05；t=4.95，P<0.05），但其上调程度远不及MCF7-WT。该结果表明，FOXQ1 介导了缺氧引起的MCF7 细胞迁移能力的增加（图4）。

图4 FOXQ1 介导缺氧引起的MCF7 细胞迁移能力的增加Fig 4 FOXQ1 mediates the increased migration of MCF7 cells induced by hypoxia

2.5 HIF-1α 可能直接转录调控FOXQ1 的表达 分析来源于METABRIC 数据库的人类乳腺癌数据，发现FOXQ1 与HIF1A（r=0.099，P<0.000 1）以及HIF-1α 的代表性下游靶基因LOX[19]（r=0.375，P<0.000 1）、LDHA[20]（r=0.136，P<0.000 1）和GLUT3[21]（r=0.213，P<0.000 1）的mRNA 表达有显著相关性；此外，在FOXQ1 的启动子上存在HIF-1α 的结合位点（图5）。

图5 HIF-1α 可能直接转录调控FOXQ1 的表达Fig 5 HIF-1α maydirectly regulate the expression of FOXQ1

3 讨论

自2013 年首次被应用于哺乳动物基因组编辑以来，CRISPR/Cas9 技术凭借其高效、精准的特点，被广泛应用于探索癌症相关基因的功能、建立荷瘤动物模型、探索药物靶点等，极大地增进了我们对癌症基因组学的认识[22-23]。在本研究中，笔者实践了一种更为方便、省时、高效的CRISPR/Cas9 解决方案，使用商品化Cas9 慢病毒和纯化的crRNA、tracrRNA 来构建CRISPR/Cas9 基因编辑体系，省去前期构建gRNA 载体或Cas9 载体的工作，极大的简化了基因编辑实验步骤。最终通过该技术，成功的构建了FOXQ1 基因敲除的MCF7 细胞株，克服了FOXQ1 在MCF7 中无法以siRNA 或shRNA 进行降表达的难题，并以此为模型在体外初步探究了FOXQ1 对缺氧环境中乳腺癌细胞迁移能力的影响。结果表明，缺氧能显著上调MCF7 细胞中FOXQ1的表达，同时也能在体外增加MCF7 细胞的迁移能力，并且该过程被FOXQ1 所介导。这初步印证了笔者的假设。

HIF-1α 是介导缺氧反应的中心转录因子，其已被广泛认为在肿瘤侵袭、转移中起关键作用[24]。在对临床数据的研究中发现，在乳腺癌中FOXQ1 与HIF1A 的mRNA 表达具有显著的相关性。同时，笔者还进一步分析了HIF-1α 的已知靶基因LOX、LDHA 和GLUT3 与FOXQ1 表达的相关性，发现仍然显著相关。并且FOXQ1 的启动子上存在HIF-1α的结合位点，因此推测FOXQ1 可能作为HIF-1α 的直接靶基因而被调节。

研究发现，Twist1、Snail、Slug、ZEB1 和ZEB2 等EMT 调节因子直接或间接受HIF-1α 的调控[25]。而据报道，Twist1、Snail 和ZEB2 也同样作为FOXQ1的下游因子调控肿瘤细胞的迁移侵袭[26-28]。同时，笔者的结果表明，FOXQ1 完全敲除后缺氧对MCF7 迁移能力的促进作用几乎完全被抑制，并且MCF7 细胞的迁移能力与FOXQ1 的表达具有一定的剂量依赖性，FOXQ1 在缺氧信号所调控的一系列细胞迁移相关下游因子中起关键作用。

总之，通过CRISPR/Cas9 系统成功构建了FOXQ1基因稳定敲除的乳腺癌MCF7 细胞株，并发现FOXQ1 介导了缺氧对MCF7 细胞迁移能力的促进作用。这些工作为今后深入研究乳腺癌的缺氧微环境中FOXQ1 的功能及其机制提供了良好的实验基础。