模拟氮沉降和接种外生菌根真菌对马尾松(Pinus massoniana)幼苗营养元素的影响

孙鹏飞,程瑞梅,2,*,肖文发,2,沈雅飞,2,曾立雄,王丽君,陈 天,张 萌,邢红爽

1 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所国家林业和草原局森林生态环境重点实验室, 北京 100091 2 南京林业大学南方现代林业协同创新中心, 南京 210037

随着人类活动产生的活性氮化合物的过度排放使大气氮沉降日益加剧,其对生态系统的影响也成为目前全球环境质量和气候变化中热议的话题[1—2]。作为最大的发展中国家,我国为全球三个高氮沉降热点区域之一,虽然氮沉降量的变化趋势由快速增长变为趋于稳定,但是总量仍然处于较高水平[3]。大气氮沉降直接或间接影响植物生长、营养元素吸收及分配过程[4]。植物从土壤中汲取营养维持和促进自身的生长发育,而诸多功能、含量和分布各异的营养元素对植物的生命活动也起到至关重要的作用[5—6]。土壤中氮含量的高低会影响植物对氮的吸收和同化能力,并影响氮在植物体内运输的差异,同时也会影响植物对其他营养元素的吸收和利用[7]。向日葵(Helianthusannuus)、百日草(Zinniaelegans)、鸡冠花(Celosiacristata)和波斯菊(Cosmosbipinnatus)在不同施氮浓度处理后,叶片氮含量均随施氮浓度的升高而升高,但施氮对4种植物其他营养元素含量的影响却不同,增加了向日葵锰(Mn)、铁(Fe)和锌(Zn)含量,增加了百日草硫(S)和Mn含量,增加了鸡冠花钙(Ca)、镁(Mg)、Fe和Mn含量。Yan等研究了施氮对拟南芥(Arabidopsisthaliana)生长和营养吸收的影响,发现施氮增加了拟南芥叶片氮含量,降低磷含量,从而增加光合固碳的量,促进植物生长[8]。在一定施氮范围内有利于植物对其他营养元素的吸收利用,而过量施氮则会导致植物营养失衡,对植物产生负面影响。

外生菌根真菌(EMF)可以与大多数植物形成共生关系,共生后产生的真菌菌丝体能够紧密地包裹植物幼根形成菌套,菌套能继续长出菌丝取代根毛延伸到土壤中形成根外菌丝体[9]。EMF具有促进宿主植物生长和营养吸收、提高植物抵抗生物和非生物逆境的能力[10—11]。Wen等发现,接种EMF的黑松(Pinusthunbergii)的氮、磷、钾含量显著高于未接种植株[12]。Wang等研究发现,接种 EMF 可以提高杉木(Cunninghamialanceolata)氮(N)、磷(P)含量,从而促进植株的光合作用和生长状况[13]。Arteaga-León研究了接种 EMF 对樟子松(Pinusayacahuite)营养元素含量的影响,发现与未接种对照相比,接种EMF提高了N、P、Mn、Fe含量[14]。可见,不同的植物和 EMF 组合、不同的生长环境,都能引起试验结果的差异。

中国是世界上拥有最大人工林的国家,植树造林已成为调节气候、减少二氧化碳排放[15],实现我国2030碳达峰和2060碳中和目标的关键。马尾松(Pinusmassoniana)作为中国南方造林先锋树种[16],是典型的外生菌根树种,关于其与外生菌根共生关系的研究开展的较早。早在1989年,陈连庆就对马尾松共生菌根进行了调查与鉴定,发现共有27种外生真菌能够与其共生[17],其中彩色豆马勃(Pisolithustinctorius,Pt)与厚环乳牛肝菌(Suillusgrevillei,Sg)是马尾松典型的优良共生菌剂[18]。陈展研究发现接种彩色豆马勃能够降低马尾松针叶的N含量,增加了P、钾(K)、Ca、Mg的含量,有利于植株针叶营养元素的积累和营养平衡[19]。于浩等发现强酸雨处理下接种外生菌根真菌能够提高马尾松幼苗根系中的N、P、Ca、Mg的含量,说明接种EMF在一定程度上可以缓解胁迫对马尾松幼苗养分元素的不利影响[20]。本研究以马尾松幼苗为试验材料,分析施氮和接种 EMF 对马尾松大量元素和微量元素含量的影响,旨在从植物营养的角度探讨 EMF 对马尾松生长的影响机制,并从氮素供应不足到氮素供应过剩的范围内评估接种EMF对马尾松幼苗营养元素吸收能力的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌种为厚环乳牛肝菌Suillusgrevillei(简称Sg)和彩色豆马勃Pisolithustinctorius(简称Pt),由中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所微生物保藏管理中提供。将冷冻干燥菌种恢复活化后接入摇臂发酵罐内震荡培养30 d,生长旺盛后作为菌剂备用。

供试植物为1年生马尾松幼苗,由湖南省林业技术推广站提供。盆栽土壤在高温蒸汽灭菌锅(121.3 ℃,103.4 kPa)连续灭菌30 min后备用。塑料花盆规格为20 cm×15 cm,用95%乙醇擦干后晾干,每盆装土3 kg,土壤理化性质为:全氮为1.01 g/kg,全磷为0.54 g/kg,全钾为1.53 g/kg速效氮为47.28 mg/kg,速效磷为8.97 mg/kg,速效钾为90.17 mg/kg,有机质为13.97 g/kg,pH为5.97。

1.2 试验设计

试验于2021年1月—2021年11月在湖北秭归三峡库区森林生态系统国家定位观测研究站进行,其地理位置为北纬30°38′14″—31°11′31″N,东经110°0′04″—110°18′41″E,该区针叶林以马尾松为主,总面积和总蓄积量占比高达48.8%和64.2%[20],氮沉降量为30 kg N hm-2a-1[21]。采用双因素随机区组试验设计,因素一为接种处理,分别为Sg、Pt和对照(CK);因素二为施氮处理,根据该地区大气年氮沉降量分为四个水平:0 kg N hm-2a-1,正常沉降30 kg N hm-2a-1,中度沉降60 kg N hm-2a-1,重度沉降90 kg N hm-2a-1,共12个处理,每个处理100盆,共1200盆。选取长势一致的马尾松幼苗,盆栽前使用70%(v/v)酒精消毒15 s,然后使用蒸馏水冲洗干净,接种时在基质上打3个“品”字形小孔,每个孔用注射器注入5 mL的菌液,在孔口用土压实,对照接入5 mL灭活的菌液。每隔2周移动1次苗木,以减小边际效应。在施氮处理前,幼苗生长3个月,以保证幼苗与EMF形成共生关系,之后每月进行一次施氮处理,将 NH4NO3溶解在1 L蒸馏水中,用喷雾器对马尾松幼苗全株及土壤进行喷施,每次分别施0(N0),0.714(N30), 1.428(N60), 2.143(N90) g/L硝酸铵溶液。

1.3 试验方法

碳含量的测定

将烘干的叶片样品研磨成细粉,过200目筛。精确称取4 mg样品,使用 Liqui TOCII分析仪(Elementar,德国)在固体模式下对叶片碳含量进行测定[22]。

氮、磷含量的测定

将烘干的叶和根的样品分别研磨成细粉,利用凯氏定氮仪(KjeltecTM 8400 Analyzer Unit,FOSS-Tecator,赫格纳斯,瑞典)测定全氮、全磷的含量[23]。钾、钙、镁、铁、锰、铜和锌含量的测定使用原子吸收分光光度计(Hitachi Z-2000, 东京, 日本)测定钾、钙、镁、铁、锰、 铜和锌的含量[24]。

1.4 数据处理

使用 SPSS 17.0进行数据处理。采用单因素和Duncan法进行方差分析和多重比较(α=0.05),用Pearson法对理化性状和马尾松元素含量进行相关分析。利用Excel 2003软件作图。图表中数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 施氮及接种 EMF 对马尾松叶片和根系碳含量的影响

由图1 可知,不同处理下马尾松幼苗叶片碳含量随施氮浓度升高先增加后降低,N60时达到最大值。在N0和N30时接种Sg的植株叶片碳含量高于接种Pt,与对照相比分别提高:24.11 g/kg、11.22 g/kg;7.76 g/kg、4.79 g/kg。在N60和N90时接种Pt的植株叶片碳含量高于接种Sg,与对照相比分别提高:24.38 g/kg、15.98 g/kg;31.92 g/kg、16.30 g/kg。未接种植株的叶片碳含量比在N90时比不施氮的未接种对照降低了7.99 g/kg。接种EMF的马尾松根系碳含量高于未接种植株,N60接种Pt根系碳含量最高。双因素方差分析表明(表1),接种处理对叶片和根系碳含量影响显著(P<0.05),施氮处理及二者交互作用对叶片和根系碳含量影响不显著(P>0.05)。

表1 施氮处理、接种处理及两者的交互作用对马尾松幼苗各项指标的影响Table 1 Effects of nitrogen treatment (N), EMF treatment (EMF), and N × EMF on the parameters of Pinus massoniana seedlings

图1 施氮及接种外生菌根真菌(EMF)对叶片和根系碳含量的影响Fig.1 Effects of N fertilization and exogenous EMF inoculation on leaf and root C concentration of Pinus massoniana seedlings数值为均值±标准差(n=6);不同的字母表示两者之间在 P<0.05的水平下差异不显著(Duncan′s test)

2.2 施氮及接种 EMF 对马尾松叶片大量元素含量的影响

由表2可知,施氮处理显著提高了马尾松幼苗叶片的N含量,与对照(N0)相比,N30、N60和N90处理均显著增加植株叶片N含量。接种EMF植株的N含量均显著高于未接种植株,且随施氮浓度升高而升高,N90时,接种Sg和Pt的N含量与对照相比分别提高了112.6%和138.6%,CK提高了95.5%。

表2 施氮与接种外生菌根真菌对马尾松幼苗叶片大量元素的影响Table 2 Effects of nitrogen application and inoculating ectomycorrhizal fungi on concentrations of micronutrients in the leaves of Pinus massoniana seedlings

不同处理下马尾松幼苗叶片P含量随施氮浓度升高呈先增加后降低的趋势(表2),接种与未接种植株均在N60时达到最大值,接种Sg和Pt的植株叶片P含量比不施氮未接种对照分别提高了166.3%、132.9%,未接种植株仅提高了24.2%,可见接种EMF的马尾松叶片P含量降低程度小于未接种植株。

接种EMF和未接种马尾松幼苗叶片K和Mg含量有相似的变化规律,随施氮浓度升高而降低,但接种EMF的植株K和Mg含量均高于未接种植株。接种Sg的马尾松幼苗叶片Ca含量在N0时出现最大值,Pt和CK在N60时出现最大值(表2)。

双因素方差分析表明(表1),接种处理对马尾松幼苗叶片N、P、K、Ca的影响极显著(P<0.01),施氮处理对马尾松幼苗叶片N、P、Mg的影响极显著(P<0.01),二者交互作用只对叶片N含量有极显著影响(P<0.01)。

2.3 施氮及接种 EMF 对马尾松叶片微量元素含量的影响

接种EMF的马尾松幼苗叶片Fe含量随施氮浓度升高先降低后升高,N60时达到最高,之后又降低(表3),且在同一施氮浓度下均高于未接种植株。未接种植株接种Fe含量随施氮浓度升高先降低后升高,在N60时出现最小值,而接种EMF植株在N60时出现最大值,接种Sg、Pt分别比对照提高73.27%和48.99%。

表3 施氮与接种外生菌根真菌对马尾松幼苗叶片微量元素的影响Table 3 Effects of nitrogen application and inoculating ectomycorrhizal fungi on concentrations of macronutrients in the leaves of Pinus massoniana seedlings

接种EMF的马尾松幼苗叶片Mn含量随施氮浓度升高先降低后升高,N60时出现最小值(表3)。未接种植株叶片Mn含量随施氮浓度升高先升高后降低,在N60时出现最大值。在N0、N30、N60和N90时,接种EMF的植株叶片Mn含量均高于未接种植株。

随施氮浓度升高,接种EMF与未接种马尾松幼苗叶片铜(Cu)含量均呈先降低后升高再降低的趋势(表3)。N0、N30时接种EMF植株叶片Cu含量低于未接种植株,N60、N90时接种EMF植株叶片Cu含量高于未接种植株。

随施氮浓度升高,接种EMF的马尾松幼苗叶片锌(Zn)含量均呈先降低后升高的趋势,不同的是接种Sg的植株叶片Zn含量最小值出现在N60时,而Pt出现在N30。未接种植株叶片Zn含量随施氮浓度升高而升高,在0—90 四个施氮浓度,接种Sg的植株叶片Zn含量均高于未接种植株(表3)。

双因素方差分析表明(表1),接种处理对马尾松幼苗叶片Fe、Mn的影响极显著(P<0.01),施氮处理对Fe的影响极显著(P<0.01),对Cu的影响显著(P<0.05),二者交互作用对叶片Fe、Mn含量有显著影响(P<0.05)。

2.4 施氮及接种 EMF 对马尾松根系大量元素含量的影响

施氮处理显著提高了马尾松幼苗根系的N含量(表4),与对照(N0)相比,N30、N60和N90处理均显著增加植株根系N含量。接种EMF植株的N含量均显著高于未接种植株,且呈随施氮浓度升高而升高的趋势,在N30、N60和N90三个施氮浓度下,接种Pt的马尾松根系N含量高于接种Sg,与对照相比二者分别提高了24.8%、23.9%(N30),53.6%、37.2%(N60),73.1%、71.6%(N90)。

表4 施氮与接种外生菌根真菌对马尾松幼苗根系大量元素的影响Table 4 Effects of nitrogen application and inoculating ectomycorrhizal fungi on concentrations of micronutrients in the roots of Pinus massoniana seedlings

接种EMF的马尾松幼苗根系P含量随施氮浓度升高先降低后升高,在N60时达到最大值后又下降(表4),且接种EMF的植株根系P含量显著高于未接种植株,N60时,接种Sg和Pt的植株根系P含量比不施氮未接种对照分别提高了40.8%、38.5%。

接种EMF和未接种马尾松幼苗根系K、Ca、Mg含量均随施氮浓度升高而降低,但同一施氮浓度下,接种EMF的植株K、Ca、Mg含量含量均高于未接种植株。(表4)。

双因素方差分析表明(表1),接种处理对马尾松幼苗根系N、P、K、Ca的影响极显著(P<0.01),对Mg影响显著(P<0.05),施氮处理对马尾松根系大量元素均有极显著影响(P<0.01),二者交互作用对叶片N、K含量有显著影响(P<0.05)。

2.5 施氮及接种 EMF 对马尾松根系微量元素含量的影响

接种EMF与未接种的马尾松幼苗根系Fe含量随施氮浓度升高先降低后升高,N60时达到最高,之后又降低,且在同一施氮浓度下均高于未接种植株(表5)。N60时,接种Sg与Pt的植株根系Fe含量与对照相比提高26.6%和28.4%。

表5 施氮与接种外生菌根真菌对马尾松幼苗根系微量元素的影响Table 5 Effects of nitrogen application and inoculating ectomycorrhizal fungi on concentrations of macronutrients in the roots of Pinus massoniana seedlings

接种EMF与未接种的马尾松幼苗根系Mn含量随施氮浓度升高先降低再升高后趋于稳定,N30时出现最小值(表5)。在N0、N30、N60和N90时,接种EMF的植株叶片Mn含量均高于未接种植株。

接种两种EMF的马尾松幼苗根系Cu含量在N0、N30时均高于未接种植株,而在N60时接种Sg的植株Cu含量低于未接种植株,N90时两种EMF植株根系Cu含量均低于未接种植株,分别降低了6.2%和3.9%。

随施氮浓度升高,接种EMF与未接种的马尾松幼苗根系Zn含量均呈先降低后升高再降低的趋势,不同的是接种Sg的植株根系Zn含量最大值和最小值分别出现在N60和N30时,而Pt出现在N0和N60,CK出现在N0和N30。(表5)。

双因素方差分析表明(表1),接种处理和施氮处理对马尾松幼苗根系Fe、Mn的影响极显著(P<0.01),对Zn的影响显著(P<0.05),二者交互作用对根系Fe和Cu含量有显著影响(P<0.05)。

3 讨论

EMF能够与宿主植物根系共生,形成菌丝体取代根毛吸收营养物质,影响植物根系和地上部营养元素的含量与分布,进而影响植物的生长光合状况和生理生活特征[46]。接种EMF已被证明可以促进马尾松幼苗的生长和养分的吸收和利用[47—48],本研究中,不同施氮浓度下,接种EMF均提高了马尾松幼苗地上部和地下部大量元素和微量元素的含量。植物生长良好时,N元素在植物体内与其他元素的比值需维持在适宜范围,超出这一范围则会使植物营养失衡,对植物生长产生负面影响,这也是氮沉降造成植物生产力下降的主要原因之一[49]。而EMF能够通过扩大宿主植物根系吸收面积获取更多的养分促进自身及宿主植物的生长[50],在土壤养分含量较低导致树木生长受限时,EMF可通过与树木根系共生后形成的更多菌丝体来帮助树木获得限制生长的营养物质(如碳、氮和磷等),从而提高宿主植物光合碳同化能力[51—52],而在菌根菌丝体丰富的土壤中,菌根共生的植物可以从短暂和阶段性获取的有机物中获得营养,且与菌根真菌共生的乔木和灌木具有较高的胞外酶活性,因此能够迅速吸收利用养分,与未共生的植物相比,在低养分状况的土壤中更容易且更多的获得的养分[53]。

以往研究发现,施氮能够提高马尾松幼苗的N吸收量,促进C的固定从而使植物光合作用增加而提高自身的生物量,进一步提高了P和K的吸收[54],接种EMF后,黑松幼苗的生物量增加,而寄主植物生长状况的改善可以通过接种EMF后增加了矿质养分,特别是N和P的含量来解释[55]。本研究结果显示,不同施氮浓度下接种EMF的马尾松幼苗地上部和地下部分N、P、K均显著高于未接种植株,这是因为EMF不但能够提高马尾松根系对土壤中无机氮的吸收与利用,而且还能使土壤中的有机氮矿化,进而被植物吸收利用,而EMF释放到土壤中的有机酸利于活化土壤中的无效钾,且菌根对K+的根系吸收速率显著高于未形成菌根的植物根系,EMF与植物共生后形成的众多菌丝体还能分泌磷酸酶、有机酸等物质使土壤中难以被植物吸收利用的难溶性P解析为容易被吸收利用的有效P[56—57]。

4 结论

本研究中,马尾松幼苗地上部和地下部的营养元素含量在施氮和接种EMF的影响下发生了一定的改变,通过对不同浓度氮添加下接种EMF的马尾松营养元素含量的研究表明:氮添加改变了马尾松大量元素和微量元素地上地下含量,增加了马尾松叶片C、P、Mn含量,降低了K、Ca、Mg和根系C及微量元素的含量,在中度氮沉降即施氮量为60 kg N hm-2a-1时达到临界值,马尾松幼苗P、Ca、Fe、Mn等元素均在N60时出现峰值,而在同一施氮浓度下,接种EMF后能够提高大多数元素的含量,这为未来气候变化情景中氮沉降增加下接种EMF可以调节植物元素含量,从而使植物达到更适应环境的元素平衡来促进自身生长提供理论依据。