稻田适养品种呆鲤的遗传多样性分析

邹 利,王金龙,2,李传武,王冬武,曾春芳,刘明求,刘 丽,谢 敏,曾 鸣

( 1.湖南省水产科学研究所,湖南 长沙,410153; 2.湖南文理学院,环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室,动物学湖南省高校重点实验室,常德市农业生物大分子研究中心,湖南 常德 415000 )

由于地理环境的差异和人工选育的方向不同,各地鲤(Cyprinuscarpio)在遗传和形态上皆发生了分化,形成了地方特有鲤品系如黑龙江鲤(C.carpiohaermatopterus)、黄河鲤(C.carpiohaermatopterus)、湘江野鲤(C.carpio)、荷包红鲤(C.carpiovar.wuyuanensis)、兴国红鲤(C.carpiovar.singguoensis)等,人工选育品种如丰鲤(C.carpiovar.singguoensis♀×C.carpiovar.mirrorsplittered♂)、建鲤(C.carpiovar.jian)、福瑞鲤(FFRCC.carpio)、芙蓉鲤(C.carpiovar.furong)等。我国传统的稻田养鱼,主要是将鲤放养于稻田环境之中,具有悠久的历史文化传承[1-2]。据《湘西土家族苗族自治州志》记载,湘西土家族苗族自治州自唐代就开始摸索在稻田中放鱼的生产方式,稻田养鱼已有1200多年的历史[3]。在湖南湘西,稻田养殖的鲤被称为呆鲤或埋头鲤,其遇汛期水涨,头埋泥中,故而得名。呆鲤肉味鲜美,是加工酸菜鱼的首选鱼料;其性情温顺,喜逆水上游,即使是放干稻田里的水也不轻易随水逃跑,是开展稻田综合种养的适养品种。呆鲤稻田养殖群体的形成,可能与上千年的稻田养殖环境有关,也可能是因为湘西山区与外界环境交流较少,相对隔离的环境使得呆鲤与其他水域和品种的鲤基因交流甚少,久而久之,便形成了这一独特的稻田养殖群体。

养殖场在未对亲鱼遗传背景进行了解的情况下,盲目地扩大繁殖,将导致群体遗传多样性下降、近交系数高、经济性状丢失、种质退化等问题[4-6]。近年来,湖南稻田综合种养发展迅速,呆鲤苗种需求量大,对呆鲤的遗传背景进行研究,对其苗种生产具有指导意义。微卫星作为一种发展迅速的分子标记,目前已广泛应用于鲤群体遗传多样性和遗传结构分析[7]、种质资源鉴定[8-9]、遗传连锁图和数量性状位点定位[10-11]等研究。

笔者以湘江野鲤野生群体和兴国红鲤池塘养殖群体作为对照,采用14个微卫星标记对3个湘黔山区的稻田养殖呆鲤群体的遗传特征与遗传结构进行研究,旨在对呆鲤的遗传信息背景进行初步探索,为呆鲤优质遗传资源的充分发掘与保护提供参考信息。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用永顺呆鲤群体采自湘西土家族苗族自治州永顺县,藕团呆鲤群体采自怀化市靖州自治县藕团乡,锦屏呆鲤群体采自黔东南苗族侗族自治州锦屏县,湘江野鲤群体采自岳阳市湘江江段,兴国红鲤群体为湖南省水产科学研究所院养殖群体(表1)。剪取试验鱼的尾鳍,置于95%乙醇中,保存于4 ℃冰箱备用。

表1 5个鲤群体样本采集信息

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

参照《分子克隆实验指南》[12],应用常规的酚-氯仿法自鳍条中提取基因组DNA。用质量分数为1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA质量,各组质量良好,可以进行后续的试验。

1.2.2 引物定制

试验采用14对在以往研究中扩增性较好的多态性微卫星引物,其中有8对引物由Crooijmans等[13]设计,另外6对引物参考文献[14-15],引物序列见表2。试验用特异性荧光引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。微卫星标记的正向引物5′端用fam、hex、tamrad、rox 4种荧光标记中的1种进行标记。

表2 14对鲤微卫星引物特征

1.2.3 PCR扩增

PCR反应总体系20 μL:10×PCR Buffer 2 μL,dNTP (2.5 mmol/L)1.6 μL,MgCl2(2.5 mmol/L)1.6 μL,上、下游引物(10 mmol/L)各0.6 μL,TaqDNA聚合酶0.5 μL,DNA模板(100 ng/μL)0.5 μL,双蒸水12.6 μL。PCR扩增程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,50～60 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,30个循环;72 ℃延伸10 min。取 3 μL PCR扩增产物,用2%琼脂糖凝胶电泳检测是否为有效扩增。

1.2.4 毛细管电泳样本制备和检测

荧光PCR产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行毛细管电泳,利用GeneScan和GeneMapper 4.0等软件进行图像收集和数据分析,统计片段碱基数。

1.2.5 数据分析

将每个基因座的不同碱基数的DNA片段作为该座位的等位基因来处理,每个座位扩增的等位基因按其碱基数,从大到小依次定义为:1、2、3、…k,统计各群体样本基因型。多态信息含量(PIC)根据Botstein等[16]的公式计算:

式中,Pi、Pj分别为第i和第j个(j=i+1)等位基因在群体中的频率,n为某一基因座位上的等位基因数。

用GenAlEx软件计算各微卫星位点在5个鲤群体中的等位基因数、有效等位基因数、杂合度、遗传分化系数和基因流等指标,并进行各群体间的分子方差分析。

用Structure软件分析群体遗传结构特征,设定群体数K的估算数值为2～5,根据群体的区分程度确定最优群体数K的值。用MEGA 4.0软件构建各群体之间的系统树。

2 结 果

2.1 微卫星位点的电泳检测结果

本试验采用的14对微卫星引物在5个鲤群体中均能稳定扩增出PCR产物,产物片段长度结果见表2。

2.2 群体遗传多样性分析

14对微卫星引物在5个鲤群体中的扩增结果见表3。平均等位基因数为16.571～19.214,平均有效等位基因数为9.420～11.143,平均观测杂合度为0.705～0.778,平均期望杂合度为0.884～0.893,平均多态信息含量为0.883～0.891。

表3 14对微卫星标记在5个鲤群体的遗传多样性参数

5个鲤群体的遗传多样性见表3。湘江野鲤平均等位基因数最多(19.214),锦屏呆鲤最少(16.571);藕团呆鲤的平均有效等位基因数最多(11.143),锦屏呆鲤最少(9.420);藕团呆鲤的香农-维纳多样性指数最高(2.551),锦屏呆鲤的最低(2.428);湘江野鲤的观测杂合度最高(0.778),锦屏呆鲤的最低(0.705)。总体上,本试验的5个鲤群体均具有较高的遗传多样性,3个呆鲤群体和湘江野鲤群体的多样性水平无明显差异。

采用哈迪-温伯格平衡的卡方检验对5个群体的14个位点进行检测发现,在5个鲤群体中均发生偏离极显著的位点有5个,锦屏呆鲤、藕团呆鲤、永顺呆鲤、湘江野鲤及兴国红鲤群体分别有12、10、7、9、8个位点表现出极显著的遗传不平衡状态,表明各群体均在一定程度上偏离了哈迪-温伯格平衡。

2.3 群体间的遗传分化分析

GenAlEx软件计算结果表明,5个鲤群体在14个位点上群体内的近交系数均为正值,平均值为0.166,群体存在不同程度的近交现象(表4)。本试验的14个位点中,仅HLJ1274 位点上的遗传分化系数大于0.05,其余位点的遗传分化系数均小于0.05,各位点群体间的遗传分化系数平均值为0.017(小于0.05),说明5个鲤群体间的遗传分化较弱。基因流与遗传分化系数为负相关的关系,基因流为3.088～27.730,各个位点基因流均大于1,其平均值为19.325,说明种群间存在一定的基因流动,遗传变异主要来自于群体内。分子方差分析结果表明,有5%的遗传方差来自于群体间,而95%的遗传方差来源于群体内个体间和个体内,个体间的遗传变异远大于群体间的遗传变异(表5)。用Structure软件对5个鲤群体遗传结构进行分析:当K=2时,兴国红鲤从5个群体中分离出来,永顺呆鲤、藕团呆鲤、锦屏呆鲤与湘江野鲤主要遗传组分相同;当K=3时,永顺呆鲤与藕团呆鲤相互分离开,并且各自形成各自的遗传组分,锦屏呆鲤介于其他2个呆鲤养殖群体之间,永顺呆鲤与湘江野鲤遗传结构更相似(图1)。

图1 5个鲤群体的遗传结构Fig.1 Genetic structure bar plot of 5 populations of common carp C. carpio

表4 14个微卫星位点在5个鲤群体中的F值和基因流

表5 5个鲤群体的分子方差分析

采用MEGA 4.0软件构建的5个鲤群体间遗传距离系统树见图2,分析结果显示,3个呆鲤群体遗传距离较近,而湘江野鲤与兴国红鲤聚为一支。

图2 5个鲤群体遗传距离系统树Fig.2 Genetic distance phylogenetic tree of 5 populations of common carp C. carpio

2.4 特有等位基因

在5个群体200尾个体的14个座位上,共有389个位点(表6)。锦屏呆鲤、藕团呆鲤、永顺呆鲤、湘江野鲤、兴国红鲤分别拥有11、16、14、19、20个特有等位基因。特有等位基因的频率普遍较低(0.013～0.056),还不能将这些基因作为区分5个群体的特异性分子标记。

表6 5个鲤群体在14 个微卫星基因座位的特有等位基因及频率

3 讨 论

3.1 5个鲤群体的遗传多样性分析

微卫星标记遵循孟德尔遗传规律,具备共显性遗传、多态性高及易于操作等优点,在鱼类种质资源评估、遗传育种等研究中已得到广泛应用[17-21]。本试验采用的14个微卫星位点,在5个鲤群体中的平均有效等位基因数为9.42～11.143,多态信息含量为0.883～0.891,观测杂合度为0.705～0.778。根据Botstein等[16]提出的衡量基因变异程度的指标,本试验中的5个鲤群体的多态信息含量均大于0.5,均为高度多态性位点。有效等位基因数、多态信息含量、杂合度的大小近似反映出群体遗传结构变异程度的高低[22-23]。湘江野鲤和3个呆鲤群体的观测杂合度为0.705～0.778,表明5个鲤群体遗传多样性均较高,具备选育潜力。本试验的5个鲤鱼群体,有效等位基因数和群体多样性高于其他学者关于鲤多样性的报道。如刘臻等[24]对湘江野鲤养殖群体和自然群体的遗传多样性进行分析指出,平均等位基因数为6.92,平均多态信息含量为0.5860、0.5347。曾繁振等[25]利用微卫星分子标记,检测荷包红鲤、兴国红鲤和长江野鲤的平均等位基因数为5.4～8.2,平均多态信息含量为0.6253～0.7775。马秀英等[26]在2个黄河鲤群体遗传多样性的研究中指出,人工养殖和野生鲤群体平均有效等位基因数分别为2.350、2.085,多态信息含量的平均值分别为0.474、0.428。除了引物和样本的差异外,最主要的原因是本试验采用的测序仪基因分型技术分辨率较高,而此前研究通常采用的聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率相对较低。运用微卫星标记对种质资源进行评估时,可将引物、片段扩增技术、基因分型技术等建立统一的标准,避免因为技术造成的误差。

从实际生产来看,由于遗传漂变以及人工繁殖过程中一些人为的因素,如亲本数量过少、近亲交配、定向选择及缺乏科学管理手段等,而造成养殖群体等位基因丢失、遗传多样性水平降低等现象[27-28]。遗传多样性的降低往往导致种群的适应能力降低、经济性状衰退、抗病能力差等,最终导致种群退化,调查研究野生群体和养殖群体的遗传多样性对鱼类种质资源的保护和人工育种具有重要意义,在以往的研究中,养殖群体的遗传多样性水平往往有所降低,纯合速度加快[27-29]。然而本试验中,3个呆鲤养殖群体的遗传多样性均处于较高水平,且遗传纯度不高,形成此现象的原因可能与湘西山区稻田养鱼历史悠久、养殖面积广、亲本群体保有量大、鱼苗繁殖量高等有关。据湘西州地方志记载,该地区在唐、宋时期就“有良田数万顷”,稻田养鱼已有发展,自新中国成立以来,稻田养殖面积基本维持在13 333～33 333 hm2;目前,湘西山区稻田鲤产量约2.0×104t,后备亲本上万尾[3]。且由于呆鲤繁殖能力强,繁殖技术容易掌握,民间一直盛行传统的“稻鱼连作”、“挑担卖鱼花”,很多农户家都有繁苗发花的小土池和沟凼。研究结果表明,目前呆鲤稻田养殖群体遗传多样性处于较高水平,具备良好选育潜力。在呆鲤育种过程中,适当增加有效亲本数量,可避免连续繁育造成的遗传多样性下降现象。

3.2 群体间遗传分化

遗传分化系数是体现群体间遗传分化程度的重要参数,由所有微卫星位点上的所有等位基因来衡量[29-30]。本试验的5个鲤群体,14个位点仅5%的变异由群体间分化导致,而总变异的95%发生于群体内。本试验中,群体间遗传分化系数<0.05,揭示整体水平的遗传分化程度较低,对5个群体等位基因频率的分析结果也验证了这一点,即群体间共有的等位基因为较高频率基因,而5个群体各自特有的大多数等位基因均属低频等位基因。虽然群体间分化程度低,但分子方差分析结果表明群体间遗传差异显著。Structure软件不受群体个体数目的限制,可基于个体的遗传组成进行群体模拟分析,是用于群体遗传结构分析的理想工具[31-32]。对5个鲤群体进行Structure亚种群数检验,通过遗传组分的分析,从呆鲤稻田养殖群体中筛选出遗传差异相对较大的群体,可为稻田适养品种的进一步选育提供科学有效的指导。Structure亚种群数检验结果显示:当K=2时,3个呆鲤养殖群体与湘江野鲤遗传组分接近,与兴国红鲤养殖群体分离开,呆鲤群体的亲本可能是源自湖南天然流域的自然群体;当K=3时,湘西永顺和怀化藕团的呆鲤养殖群体相互分离开,并且各自形成独具特色的遗传组分,其中湘西永顺的呆鲤养殖群体与湘江野鲤遗传结构更相似,而黔东南锦屏县的呆鲤养殖群体介于其他2个呆鲤养殖群体之间。推测发生这种现象的结果可能是,湘江永顺呆鲤群体其亲本是收集自天然水域的自然群体,而且该群体亲本数量足够多,而怀化藕团的呆鲤已经与湘江野鲤产生了一定的遗传分化。

笔者对呆鲤的遗传学信息背景进行了初探,并为稻田呆鲤品种选育与遗传改良提供理论基础。5个鲤群体的遗传多样性和遗传结构研究表明,5个群体均具有较高的遗传多样性,湘西呆鲤之所以不随水逃跑,可能与千年的稻田养殖模式有关,而群体间遗传分化水平和遗传结构表明,呆鲤养殖群体与湘江野鲤并未产生明显分化。湘西永顺呆鲤群体的遗传信息表明,其具有良好的育种潜力,而怀化藕团呆鲤群体与湘江野鲤群体在遗传结构上已经产生差异,具有选育潜力,这2个呆鲤养殖群体均可以自身群体为基础,为稻田鲤品种遗传育种和改良提供优良的种质资源。

4 结 论

本试验结果表明,湘西永顺、怀化藕团和黔东南锦屏3个呆鲤养殖群体的遗传多样性均处于较高的水平,具备良好选育潜力,但遗传纯度不高,需要进一步提纯复壮。湘西永顺和怀化藕团的呆鲤养殖群体相互分离开,并且各自形成独具特色的遗传组分,其中湘西永顺的呆鲤养殖群体与湘江野鲤遗传结构更相似,而黔东南锦屏县的呆鲤养殖群体介于其他2个呆鲤养殖群体之间,怀化藕团的呆鲤已经与湘江野鲤产生了一定的遗传分化。

致 谢

本论文数据处理过程中,得到上海交通大学海洋学院曾聪博士的指导,特此感谢!