基因组学在脑血管病中的应用

王 星 张敬军

山东第一医科大学第二附属医院神经内科，山东 泰安 271000

脑血管病是常见病、多发病，也是致残的主要原因之一，不仅严重影响患者的生活质量，而且给患者家庭带来沉重负担[1］。脑血管病的发生受遗传及环境等多种因素共同影响，遗传因素一直是脑血管病发生的高危因素，其发病机制尚未完全阐明[2-3］。近年来，随着连锁分析、全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）、全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）、全外显子测序（whole exome sequencing，WES）等多种分子遗传学技术的发展，为临床诊疗工作提供了有效手段，从罕见病到遗传病，基因组学改变了我们对生物学的认识，并影响了对许多疾病病理生理学的理解，为多种复杂疾病的研究及诊疗提供了新的思路[4］。目前这些基因组学方法在研究脑血管病上的应用相对较少，本文就多种基因组学方法在脑血管病中的应用进展进行综述。

1 连锁分析在脑血管病中的应用

连锁分析是一种依赖于参数的统计学方法，对具有与遗传标记（微卫星、限制性位点多态性等）附近位置共同遗传倾向的基因组区域进行参数统计分析[5］，通过将遗传标记的传递与家族中的疾病状态相匹配，可以将致病区域或基因座与给定标记相关联[6］。

通过连锁分析已经定位了部分脑血管病的致病基因，包括与烟雾病有关的染色体17q25上的RNF213基因[7］，与常染色体显性遗传病合并皮质下梗死和白质脑病（cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL）有关的染色体19p13上的NOTCH3基因[8］，与伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体隐性遗传性脑动脉病（cerebral autosomal recessive arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CARASIL）有关的染色体10q25上的HTRA1基因[9］，与Fabry 病有关的染色体Xq21 上的GLA基因[10］等。该研究方法需要大量准确的家系样本数据，存在一定的局限性，仅适用于致病性高、遗传变异敏感度高的单基因疾病，不适用于复杂性疾病的诊断。

2 候选基因关联研究在脑血管病中的应用

候选基因的关联研究主要集中在病因学、流行病学、组织表达特异性、功能分析以及与已知功能基因的同源比较，研究可能与其发病机制相关的候选基因，然后鉴定导致功能或表达变化的基因或邻近基因的突变，或对引起功能改变的突变形成连锁不平衡的多态性的研究。候选基因关联研究主要适用于多基因复杂疾病的研究，研究方法是通过比较病例组和对照组之间候选基因的等位基因频率的差异来确定候选基因与疾病的相关性[11］。

候选基因一部分来源于GWAS 分析，另一部分来源于脑血管病相关危险因素的易感基因。目前通过候选基因关联研究已发现脑血管病的发生受多种基因多态性的影响，如AGT基因的M235T多态性与缺血性脑血管病关系密切[12］，ApoE基因多态性与出血性脑血管病的发生密切相关[13］。候选基因关联研究补充了危险因素对脑血管病的影响机制，为脑血管病的精准防治提供新的理论依据。但该研究方法一般仅针对单个基因进行研究，且脑血管病受多种危险因素影响，候选基因研究方法在多基因疾病等复杂疾病的分子遗传决定因素方面进展甚微。

3 GWAS在脑血管病中的应用

GWAS是一种通过大规模比较患病和未患病的群体DNA 样本，进行全基因组高密度遗传标记分型，从而寻找与复杂疾病相关联的遗传因素的研究方法。在基因组水平上对基因与疾病关联进行集中、大型、反复验证研究，弥补了连锁分析的不足，全面揭示与疾病发生、发展和治疗相关的遗传基因，已经成功破译了多种复杂性状和疾病的遗传变异密码[14］。

2018 年Malik 等[15］通过整合多个GWAS 数据库，最终确定了32个脑血管病位点，其中包括22个新发脑血管病位点。2021 年Mishra 等[16］对多个脑血管病数据库进行汇总，其数据来源包括欧洲、东亚、南亚等共5 个地区，通过Meta 分析最终确定了89 个脑血管病位点，其中新发现了60 个脑血管病位点。同年，Traylor 等[17］首次对欧洲人群的腔隙性脑梗死患者进行GWAS研究，共发现了11个新的腔隙性脑梗死位点，在此之前，只在chr16q24 上发现一个与腔隙性脑梗死有关的位点，这一发现给腔隙性脑梗死的遗传机制提供了新的见解。迄今为止，通过GWAS 技术已经发现了上百个与脑血管病相关的易感基因位点，为探究脑血管病的发病机制和药物开发提供了新的思路。

GWAS的局限性：（1）由于GWAS可能对疾病易感性产生显著影响，且由于存在种族差异性，导致部分GWAS 确定的常见遗传变异与疾病无直接相关性或难以验证[18］；（2）GWAS得到的遗传变异大多位于非编码区，只能解释遗传变异的一小部分[19］；（3）GWAS 研究要求较大的样本量，且实验费用昂贵；（4）GWAS不能检测导致疾病的超罕见突变。

4 WGS在脑血管病中的应用

全基因组测序是对未知基因组序列的物种进行个体的基因组测序，可以检测到全基因组中数量大而多的序列变异。全基因组测序是一种快速、全面检测基因突变的工具，取代传统的耗时的分子筛选方案，为临床表型的遗传原因鉴定提供了另一种选择。

在2 例 中国CADASIL 患者的WGS 中发 现1 个新的杂合NOTCH3致病性变异，位于其第2 号外显子的p.Cys43Ser[20］。文献报道瑞典的1个脑血管病家系研究中发现1个MAP3K6突变，MAP3K6基因变异参与血管生成，与脑血管病的病理变化相匹配[21］。由于WES的出现，能捕获全基因组85%以上的遗传变异，且相较于WGS费用较少，导致WGS在脑血管病中的应用减少。

5 WES在脑血管病中的应用

WES 是指利用序列捕获技术捕获基因组整个外显子区域的DNA，并进行高通量富集后测序的基因组分析技术，用于研究蛋白质功能区的基因突变[22］。WES是针对基因组中的所有蛋白质编码区，约占人类基因组序列的1% ~ 2%，但这1% ~ 2%的基因序列包括了人体约85%的遗传变异[23］，弥补了GWAS 得到的遗传变异大多位于非编码区这一缺点，且WES 可以用于家系或者个体研究，相较于GWAS，有着低成本、适用范围广等优点，深受国内外临床医师和研究学者的青睐。

在国内，Zhang等[24］通过分阶段对3 754例中国汉族受试者进行WES 分析发现2 个新的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与缺血性脑血管病有关。研究者第一阶段选取本地区少量缺血性脑血管病患者和健康对照进行WES，得到高度相关性的76个SNP；第二阶段在本地区加大样本量，对高度相关性SNP 进行基因分型，最终确认了4 个SNP 与缺血性脑血管病有关；第三阶段在同种族其他地区复制了阳性相关性SNP。经过三个阶段最终确定位于染色体1q24.2 和3p21.3 的2 个SNP 与缺血性脑血管病有关。林晶等[25］在1 个CADASIL 家系中揭示了一种新的突变为NOTCH3基因，位于第3号外显子上的碱基改变，使第111个氨基酸由甘氨酸变为半胱氨酸，造成半胱氨酸数量不配对，促使CADASIL 的发生。Chang 等[26］通过对1 个脑海绵状血管畸形相关脑出血家族进行WES研究，发现了1个新的变异体KRIT1。

在国外，Ilinca 等[27］通过对22 例缺血性脑血管病青年患者的研究发现NOTCH3突变，研究者首先对22 例先证者进行WES，发现8 个可能致病的突变，通过Sanger测序后缩小为6个，然后对有可能致病变异的5 个家系成员进行基因分型，确定了NOTCH3突变与脑血管病有关。Paraskevas 等[28］在1 个CADASIL 合并自身免疫性疾病家系中发现共有突变NOTCH3p.R169C。Carrera 等[29］通过病例对照研究发现一个与心源性脑血管病有关的新基因TRPV3，研究者通过对40 例心源性脑血管病患者、21例健康对照和13例有其他临床危险因素的对照进行WES，发现TRPV3突变与心源性脑血管病的发生具有相关性，对TRPV3 编码蛋白功能进行分析，TRPV3编码蛋白参与血管调节的离子通道，与房颤的发生有关，而房颤是心源性脑血管病的主要危险因素，最后得到TRPV3突变是引发心源性脑血管病的一个致病位点。Xie 等[30］通过对英国生物库的152 058 例缺血性脑血管病患者WES 数据进行分析，发现基因CYP2R1与缺血性脑血管病的发生有关。美国国家心脏、肺和血液研究所外显子测序计划分析了来自欧洲和非洲血统众多队列的约6 000例参与者WES 数据，发现2 个新基因PDEDIP和ACOT4与缺血性脑血管病风险增加有关[31］。

关于脑血管病的WES研究在国内外均有报道，新发现了部分与脑血管病有关的致病基因，丰富了脑血管病的基因谱，但WES 也有一定的局限性：（1）WES 仅分析编码区的变异信息，缺少非编码区变异和结构变异的研究，可能会导致一定程度的信息遗漏；（2）WES 研究对测序平台、实验器械、实验技术等有着苛刻的要求，具备实验条件的实验室少，不能广泛开展实验；（3）由于个体、种族间存在差异性，需要重复加大样本进行验证，验证成本高。

6 表观遗传学在脑血管病中的应用

表观遗传学是分子生物学的一个分支，用于弥补遗传风险因素临床转化的不足，研究能够改变基因表达而不改变DNA 序列的修饰。表观遗传调节包括DNA 甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA[32］。其中DNA 甲基化通过修饰基因组中存在的CpG 位点中的胞嘧啶残基在基因转录的开启、关闭中发挥重要作用，组蛋白的翻译后修饰可以改变染色质对转录调节元件的可达性，而miRNA通过与mRNA相互作用在转录后水平调节基因表达[33-35］。这些基因修饰是可遗传和可修改的，可以由生活方式和营养因素触发，由于表观遗传修饰是可逆的过程，因此，它们可以帮助开发治疗人类疾病的新治疗方法。

Cullell 等[36］通过表观基因组关联研究DNA 甲基化与缺血性脑血管病的相关性，发现MAP3K1和ZFHX3 的DNA 甲基化改变是心源性和动脉粥样硬化性脑血管病发生的危险因素，ZFHX3甲基化也是腔隙性脑血管病的危险因素。Silva 等[37］通过使用人缺血性脑血管病病变组织和公开的对照RNASeq数据进行全局表达分析，发现2个新的缺血性脑血管病生物标志物has_circ_0078299和FXN。文献报道lnc_000048 可以通过募集KDM1A 影响组蛋白去甲基化酶活性，通过在启动子区域积累H3K4me2促进MAP2K2 转录，进一步加速ERK 磷酸化，最终促进下游炎症因子，诱导动脉粥样硬化的形成[38］。所有表观遗传标记都是由基因和环境相互作用的结果，可以帮助我们深入了解脑血管病发病机制，从而为脑血管病的防治提供新的方向[39］。

7 展望

随着测序技术的不断变革和进步，基因组学在脑血管病中的应用研究不断深入，为脑血管病的发病机制和药物靶点的探寻提供更多的数据及理论支撑。现阶段的每种测序手段都存在优缺点，研究下一代测序方法可以弥补既往不足，能够快速、高效、精准、廉价地确定患者的致病原因，为脑血管病的精准防治提供理论依据。

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