急性缺血性脑卒中患者血清CKLF1、claudin-5预测溶栓后出血转化的价值及与短期预后的关系

刘源,刘星,禹红,熊武忠,王乐

急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)是临床最常见的卒中类型,据中国脑卒中防治报告,2019年我国脑卒中发病率为201/10万,死亡219万人,其中AIS发病率为145/10万,死亡103万人,AIS已成为我国居民死亡的主要原因之一[1]。静脉溶栓是在时间窗内恢复AIS血流灌注的最有效手段,能快速恢复缺血半暗带血流灌注改善缺损神经功能[2]。出血转化(hemorrhagic transformation,HT)作为静脉溶栓后最常见、最严重的并发症,严重影响AIS患者预后[3]。目前尚无预测静脉溶栓后HT可靠的方法或手段,研究表明, 炎性反应等机制引起的血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)破坏是HT发生的重要原因之一[4-5]。趋化素样因子1(chemokine-like factor 1,CKLF1)是一种C-C趋化因子,能通过结合C-C基序趋化因子受体(C-C motif chemokine receptor,CCR)4/5触发一系列炎性细胞因子释放,促进炎性反应发生发展[6]。claudin-5是一种跨膜蛋白,对维持BBB紧密连接至关重要,其结构和分布异常与BBB破坏密切相关[7]。目前,关于血清CKLF1、claudin-5与AIS患者静脉溶栓后HT的关系尚不清楚,现分析AIS患者血清CKLF1、claudin-5预测静脉溶栓后HT的价值及与短期预后的关系, 报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年7月—2021年1月武汉市中医医院神经内科收治接受静脉溶栓的AIS患者321例为AIS组,男203例,女118例;年龄42～76(58.86±9.94)岁;体质量指数19.74～28.45(23.60±1.71)kg/m2。另选取医院同期体检健康志愿者60例为健康对照组,男38例,女22例;年龄36～80(57.85±8.31)岁;体质量指数19.95～26.89(23.35±1.59)kg/m2;2组性别、年龄、体质指数资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经武汉市中医医院医学伦理委员会批准(20190179),受试者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①AIS符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[8]中相关诊断标准,且为初次发病;②发病至入院时间<4.5 h,具备静脉溶栓适应证[9],并完成常规剂量静脉溶栓;③年龄≥18岁;④入院时完成实验室检查及颅脑CT检查。(2)排除标准:①脑出血或既往脑出血病史;②近3个月内脑外伤或既往脑部手术史;③静脉溶栓禁忌证(正在服用口服抗凝药、国际标准化比值>1.7等)[9];④血管内介入治疗(动脉溶栓、机械取栓、桥接治疗等);⑤AIS前已合并中枢神经系统疾病;⑥血液、免疫系统损害,恶性肿瘤,严重心、肝、肾、肺功能损害;⑦临床资料不全;⑧多次溶栓;⑨院内死亡、不能接受随访。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清CKLF1、claudin-5水平检测:AIS患者入院翌日晨和健康对照组体检时采集空腹肘静脉血5 ml,离心留取上层血清。采用酶联免疫吸附法检测血清CKLF1(试剂盒为深圳海思安生物技术有限公司,货号HAS-51562)、claudin-5(试剂盒为武汉伊艾博科技股份有限公司, 货号E11713h)水平。

1.3.2 HT判定和分组:AIS患者静脉溶栓后48 h内或症状变化时再次行头颅CT/MR检查,参考《中国急性脑梗死后出血转化诊治共识2019》[10]:脑梗死后首次头颅CT/MR未发现出血,而再次头颅CT/MR检查时发现有颅内出血,或根据首次头颅CT/MRI可以确定的出血性梗死判定为HT。根据是否发生HT将AIS患者分为HT亚组和非HT亚组。

1.3.3 预后判定和分组:AIS患者静脉溶栓出院后通过电话或门诊复查随访3个月,随访截止于2021年4月,通过改良Rankin量表(modified Rankin scale,mRS)评估预后,总分值0～6分,≥3分表示预后不良[11]。根据mRS评分将AIS患者分为预后不良亚组和预后良好亚组。

2 结 果

2.1 AIS组与健康对照组血清CKLF1、claudin-5水平比较 AIS组血清CKLF1、claudin-5水平高于健康对照组(P<0.01),见表1。

表1 健康对照组与AIS组血清CKLF1、claudin-5水平比较 [M(Q1,Q3),ng/L]Tab.1 Comparison of serum CKLF1 and claudin-5 levels between healthy control group and AIS group

2.2 AIS患者静脉溶栓后HT发生在不同临床病理特征中差异分析 321例AIS患者静脉溶栓后发生HT 63例(19.63%)。与非HT亚组比较,HT亚组患者年龄较大,心房颤动、心源性栓塞比率高,NIHSS评分高,CKLF1、claudin-5水平高(P均<0.01),见表2。

表2 AIS患者静脉溶栓后HT发生的因素分析Tab.2 Analysis of factors affecting the occurrence of HT in AIS patients after intravenous thrombolysis

2.3 AIS患者静脉溶栓后HT的多因素Logistic回归分析 以AIS患者静脉溶栓后是否出现HT为因变量,以上述结果中P<0.05项目为自变量,进行多因素Logistic回归分析,结果显示,心源性栓塞、NIHSS评分升高和血清CKLF1、claudin-5水平升高为AIS患者静脉溶栓后HT的独立危险因素(P<0.01),见表3。

表3 AIS患者静脉溶栓后HT的多因素Logistic回归分析Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of HT after intravenous thrombolysis in AIS patients

2.4 不同预后AIS患者血清CKLF1、claudin-5水平比较 AIS患者321例静脉溶栓后3个月mRS评分≥3分88例,预后不良发生率为27.41%(88/321)。预后不良亚组血清CKLF1、claudin-5水平高于预后良好亚组(P<0.01),见表4。

表4 不同预后AIS患者血清CKLF1、claudin-5水平比较 [M(Q1,Q3),ng/L]Tab.4 Comparison of serum CKLF1 and claudin-5 levels in AIS patients with different prognosis

2.5 AIS患者血清CKLF1、claudin-5水平与mRS评分的相关性 Spearman相关性分析显示,AIS患者血清CKLF1、claudin-5水平与mRS评分呈正相关(rs=0.517、0.491,P均<0.001)。

2.6 血清CKLF1、claudin-5水平对AIS患者静脉溶栓后HT的预测价值 绘制血清CKLF1、claudin-5水平对AIS患者静脉溶栓后HT的预测价值ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示,血清CKLF1、claudin-5水平单独及二者联合预测AIS患者静脉溶栓后HT的AUC分别为0.769、0.772、0.876,二者联合预测的AUC大于CKLF1、claudin-5单独预测(Z/P=2.542/0.011,3.786/<0.001),见表5、图1。

图1 血清CKLF1、claudin-5水平预测AIS患者静脉溶栓后HT的ROC曲线Fig.1 Serum CKLF1 and claudin-5 levels predict the ROC curve of HT in AIS patients after intravenous thrombolysis

表5 血清CKLF1、claudin-5水平对AIS患者静脉溶栓后HT的预测价值Tab.5 Predictive value of serum CKLF1 and claudin-5 levels for HT after intravenous thrombolysis in AIS patients

3 讨 论

HT是指AIS后缺血区域血管在恢复血流灌注后导致的出血,静脉溶栓虽然能通过溶解血管内堵塞血栓,使阻塞血管重新获得血流灌注,但溶栓药物的抗血栓作用还能引起纤维蛋白原降解和破坏BBB,导致HT发生[12]。HT可导致静脉溶栓后神经功能改善的AIS患者神经功能再次恶化，是AIS患者预后不良的危险因素之一[13]。本研究中,321例AIS患者静脉溶栓后HT发生率为19.63%,这与姜文娟等[14]报道的21.38%接近,说明AIS患者静脉溶栓后HT发生率较高。因此,早期识别HT发生对改善AIS患者预后具有重要意义。

BBB破坏被认为是HT关键的机制,AIS后神经细胞缺血死亡能释放“危险信号”激活脑内固有免疫反应,促进活性氧、炎性细胞因子、趋化因子等神经毒性物质产生,引起神经炎性级联反应,破坏BBB导致HT发生[15-16]。趋化因子是一类在机体血管新生、细胞增殖、炎性反应、免疫调节等多种病理生理过程中发挥重要作用的分子蛋白[17]。CKLF1是新近发现的一种主要表达于单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等免疫细胞的趋化因子,具备C-C趋化因子的结构和特征,能通过C端结合CCR4/5,不仅能趋化免疫细胞迁移至炎性反应部位,还能激活核因子-κB、细胞外调节蛋白激酶、丝裂原活化蛋白激酶、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3等一系列转录因子,在炎性反应中发挥重要作用[18]。研究报道[19],抑制CKLF1与CCR4结合能抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3活化,进而减少局灶性缺血性脑损伤后炎性反应。敲低CKLF1能抑制CKLF1/CCR5介导的中性粒细胞迁移,减轻脑缺血大鼠脑内炎性反应[20]。同时Zhou等[21]研究报道,下调CKLF1能抑制核因子-κB激活,进而抑制大鼠脑卒中后小胶质细胞M1型极化。上述研究表明,CKLF1与脑卒中神经炎性反应密切相关,而神经炎性反应与BBB破坏密切相关,因此笔者推测CKLF1可能参与HT发生。本研究结果显示,AIS患者血清CKLF1水平升高,且是静脉溶栓后HT发生的独立危险因素,说明血清CKLF1水平升高会增加AIS患者静脉溶栓后HT风险。分析原因可能是CKLF1升高能结合其受体CCR4/5趋化免疫细胞至炎性反应部位,并激活多条炎性反应信号通路,导致神经炎性反应并破坏BBB[22],进而增加HT风险。实验也显示[23],抑制CKLF1能通过抑制炎性反应减少BBB基底膜降解,维持BBB完整性和通透性,进而改善大鼠脑缺血BBB功能。于大君等[22]临床研究也报道,外周血CKLF1升高与高血压脑出血患者BBB破坏有关。

BBB由一层紧密排列的无孔内皮细胞单层形成,这些细胞通过紧密连接蛋白复合物机械连接在一起,严格限制了循环血液和大脑微环境之间的分子交换,细胞紧密连接蛋白缺失将导致BBB渗透性损害,导致HT发生[24]。claudin是构成内皮细胞紧密连接的主要蛋白,其中claudin-5是BBB中最富集的紧密连接蛋白,其表达浓度直接决定了BBB紧密连接部分的渗透性[25]。肖志博等[26]研究报道,上调缺血区域claudin-5表达能保护脑缺血再灌注后BBB完整性。Gholamzadeh等[27]研究报道,上调脑组织claudin-5表达能改善大脑中动脉闭塞大鼠BBB完整性。上述研究表明,claudin-5对保护脑卒中后BBB完整性至关重要,然而关于claudin-5与AIS患者静脉溶栓后HT的关系尚未可知。本研究结果显示,AIS患者血清claudin-5水平升高,是静脉溶栓后HT发生的独立危险因素,说明血清claudin-5水平升高会增加AIS患者静脉溶栓后HT风险,这与上述研究报道claudin-5具有BBB保护作用结果不相符。分析原因可能是血清claudin-5水平升高由BBB被破坏渗漏所致,故血清claudin-5水平越高反映BBB破坏越严重,导致更多的claudin-5自BBB渗漏至血液循环中[28]。

本研究结果还显示,心源性栓塞和NIHSS评分增加也是AIS患者静脉溶栓后HT的独立危险因素,分析原因可能是心源性栓塞反映患者心脏结构和功能存在损害,心脏输出量降低影响脑血管功能,增加HT风险;NIHSS评分越高反映患者病情越危重,BBB破坏可能更严重,因此HT风险更高[29-30]。本研究通过分析血清CKLF1、claudin-5水平与短期预后的关系发现,预后不良亚组血清CKLF1、claudin-5水平明显升高,且AIS患者血清CKLF1、claudin-5水平与mRS评分呈正相关,这说明血清CKLF1、claudin-5水平升高与AIS患者静脉溶栓后短期预后密切相关。分析原因可能是血清CKLF1、claudin-5水平升高会加剧AIS患者BBB破坏,导致神经功能持续恶化,进而影响预后[31-32]。本研究ROC曲线显示,血清CKLF1水平为40.01 ng/L时,预测AIS患者静脉溶栓后HT的AUC为0.769;血清claudin-5水平为93.33 ng/L时,预测AIS患者静脉溶栓后HT的AUC为0.772;血清CKLF1联合claudin-5预测AIS患者静脉溶栓后HT的AUC为0.876,较CKLF1、claudin-5单独预测更大。说明静脉溶栓前检测血清CKLF1、claudin-5水平有助于预测AIS患者静脉溶栓后HT发生,且二者联合能提升预测价值。

综上所述,AIS患者血清CKLF1、claudin-5水平升高,与静脉溶栓后HT发生和短期预后不良密切相关,血清CKLF1、claudin-5水平对AIS患者静脉溶栓后HT具有一定预测价值,且二者联合能提升预测价值。但本研究结果还需多中心大样本研究证实。

利益冲突:所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

刘源:提出研究思路,设计研究方案,论文撰写,论文修改;刘星:实施研究过程,文献调研与整理;禹红:分析试验数据,论文终审;熊武忠、王乐:数据收集,统计学分析