青海省互助县藏羊部分疾病的血清学调查

王林业,章石楠,胡国元,石 田,李淑萍,韩生义*

(1.互助县红崖子乡畜牧兽医站,青海 互助 810507;2.青海大学畜牧兽医科学院,青海省动物疾病病原诊断与绿色防控技术研究重点实验室,青海 西宁 810016)

传染性胸膜肺炎、小反刍兽疫和巴氏杆菌病是藏羊养殖中重要的传染病,对养羊行业危害极大[1]。其中,传染性胸膜肺炎又被称为羊支原体病,是由山羊支原体山羊亚种、丝状支原体山羊亚种以及绵羊肺炎支原体引起的一种高度接触性传染病,该病的发病率和死亡率都很高[2,3],在我国大部分省份均有不同程度的流行,尤其在河北、河南和山东等地较为严重。此外,青藏高原、蒙新高原及其邻近地区也是羊支原体病的高发地[4]。2006-2008年在对青海省绵羊支原体的血清学调查中发现,青海省绵羊支原体感染率高于西部其它地区[5]。

小反刍兽疫又称羊瘟,是由小反刍兽疫病毒引起的一种烈性传染病,其发病率及死亡率可高达100%[6],以发烧、口腔溃疡、胃炎、腹泻以及肺炎为主要特征[7]。该病极易通过直接接触、间接接触及飞沫传播进行扩散,部分病羊痊愈后其排泄物和分泌液中仍能检测出病毒残留[8]。小反刍兽疫于2013年首次在新疆爆发,2013-2021年国内报告了5 934例病例,发现疫情主要集中在东北和西北地区,其中青海报告病例数占全国总病例的4.80%[9]。

羊巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的一种重要传染病,具有潜伏期短、传播速度快、死亡率高、可呈爆发性流行等特点,其中急性病例以败血症、出血性炎症和急性死亡为主要特征,慢性病例常表现为肺炎、皮下结缔组织和关节及脏器出现化脓性病灶[10]。多杀性巴氏杆菌按荚膜类型可分为A、B、D、E和F 5种血清型,国内羊源多杀性巴氏杆菌主要以B型为主[11]。目前,青海省羊巴氏杆菌病的发病率和病原特性等流行病学特征暂无相关调查数据。

鉴于以上3种羊的重要传染病近年来在青海省缺乏可靠的调查数据,本研究采用ELISA抗体检测方法对青海省互助县部分藏羊养殖场开展了羊传染性胸膜肺炎、小反刍兽疫和羊巴氏杆菌病的血清学检测调查,旨在掌握青海省藏羊重要传染病的流行情况,为藏羊健康养殖和疫病防控提供数据支持和科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品

从青海省互助县3个藏羊养殖合作社采集藏羊血液样品共计80份,于4℃条件下保存,待血清析出后,收集血清冷冻保存,待检。

1.2 试验试剂

支原体ELISA抗体检测试剂盒(哈尔滨国生生物有限公司);小反刍兽疫竞争ELISA抗体检测试剂盒(兰州兽研生物科技有限公司);多杀性巴氏杆菌抗体(PM-Ab)ELISA科研试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1羊传染性胸膜肺炎 根据支原体ELISA抗体检测试剂盒说明书进行检测,具体操作如下:

设置阴性对照及阳性对照,各做2个重复,将阴、阳性对照血清及待检测样品加入到包被板相应孔中,100 μL/孔。在37℃条件下孵育1 h。

孵育结束后,甩去包被板各孔中的液体,用洗涤液洗涤包被板,250 μL/孔,洗涤3次。

向各孔加入兔抗牛IgG酶标抗体,100 μL/孔,在37℃条件下孵育1 h后洗涤。

加入底物显色液,100 μL/孔,室温避光孵育9 min。

加入终止液,15 min内在450 nm波长下读取 OD值。

判定标准:当阳性对照血清OD450nm值≥0.8、阴性对照血清 OD450nm值<0.1时试验结果有效。待检样品的S/P值≥0.418时,判定为阳性,待检样品的S/P 值<0.418时,判定为阴性。

1.3.2小反刍兽疫 根据小反刍兽疫竞争ELISA抗体检测试剂盒说明书进行检测,具体操作如下:

设置阴性对照血清2孔和阳性对照血清2孔,每孔加入相应血清50 μL;空白对照2孔,每孔加100 μL 1×PBST;单克隆抗体对照4孔,每孔加50 μL 1×PBST溶液。

待检血清孔每孔加入待检血清样品50 μL。除空白对照外,其他各孔加单克隆抗体工作液50 μL,在37℃条件下孵育1 h。

取出酶标板甩干,用1×PBST洗涤4～5次;每孔加入免抗鼠酶标工作液50 μL,在37℃条件下孵育1 h后洗涤。

每孔加入底物溶液50 μL,置37℃避光静置反应15 min。

每孔加入50 μL终止液。450 nm波长下读取各孔的OD值。

判定标准:当阴性对照血清PI<40%、阳性对照血清PI>60%时检测结果成立,否则该次检测结果无效。诊断或进行流行病学调查时,待检血清PI≥50%为阳性,PI<50%为阴性。

1.3.3多杀性巴氏杆菌 根据多杀性巴氏杆菌抗体(PM-Ab)ELISA科研试剂盒说明书进行检测,具体操作如下:

设置阴、阳性对照孔和样本孔,阴、阳性对照孔中加入相应血清各 50 μL;样本孔先加待测样本 10 μL,再加样本稀释液40 μL。

阴、阳性对照孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗原100 μL,在37℃条件下孵育1 h。

弃去孔中液体,用吸水纸拍干,每孔加满洗涤液,静置 1 min,甩去洗涤液,如此重复洗板 5次。

每孔加入底物A、B各50 μL,在37℃条件下避光孵育15 min。

每孔加入终止液50 μL,15 min内在450 nm波长处测定各孔的 OD 值。

判定标准:当阳性对照孔OD平均值≥1.00、阴性对照孔OD平均值≤0.15时,样品OD值<临界值判为阴性,样品OD值>临界值判为阳性。

2 结果

由表1可见,在80份被检血清中,支原体阳性0份,阳性率为0;小反刍兽疫阳性30份,阳性率为37.50%;多杀性巴氏杆菌阳性1份,阳性率为1.25%。

表1 互助县藏羊养殖场血清抗体阳性率检测结果

3 讨论

在本次检测的80份藏羊血液样本中,支原体、小反刍兽疫病毒和多杀性巴氏杆菌病的抗体的阳性率分别为0、37.50%和1.25%。通过对上述3个养殖场进行实地走访和调查,未发现明显的羊传染性胸膜肺炎和羊巴氏杆菌发病情况。据报道,新疆、甘肃、陕西和内蒙地区的血清样品中,羊传染性胸膜肺炎抗体和巴氏杆菌抗体阳性率较高,分别为98%和94.22%[12];内蒙古呼伦贝尔和拉萨羊病料中多杀性巴氏杆菌的分离率分别为60%[13]和22.20%[14]。与以上地区相比,青海省藏羊传染性胸膜肺炎和巴氏杆菌病发病率很低。研究发现,我国西北地区为小反刍兽疫的高发地区,小反刍兽疫是一种急性病毒性传染病,世界卫生组织将其规定为必须报告的疫病,我国农业农村部将其列为一类动物疫病。其特征是发病急剧、高热稽留、眼鼻分泌物增加、口腔糜烂、腹泻和肺炎[15]。

这3种疫病都极具传染性,且发病率和死亡率很高,一旦感染会对畜牧业发展带来巨大威胁,因此在藏羊养殖过程中应加强防控工作,对羊群进行定期监测,并对养殖场进行定期消毒,制定规范的疫苗免疫程序,定期进行预防接种。