依达拉奉对心肌重构小鼠AT1R/ StAR/ MR信号通路的影响

薛阳阳 秦窈窈 高建辉 岳鸾依 张玮玮 余淑珍

1.山西医科大学麻醉学院，山西太原 030001；2.山西医科大学第五临床医学院，山西太原 030001；3.山西医科大学附属省人民医院麻醉科，山西太原 030012

心力衰竭死亡率快速上升，已成为严重威胁公众生命的重大问题[1]。我国心力衰竭发病率逐年上升，临床规范治疗下5 年病死率达半数以上[2-3]。压力超负荷致病理性心肌重构是心力衰竭独立危险因素[4]。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）是压力超负荷致心肌重构的主要机制之一[5]。盐皮质激素受体（mineralocorticoid receptors，MR）拮抗剂虽然可以特异性拮抗MR，治疗心肌重构、缓解心力衰竭[6]，但有高钾血症、血肌酐升高、头晕、疲乏、腹泻等副作用[7]。因此，如何进一步针对性治疗仍然面临重要挑战。依达拉奉具有抗凋亡、抗坏死、抗炎细胞因子和清除自由基的作用[8]。近年来研究表明，除神经系统外依达拉奉对心脏和血管同样具有保护作用[9-11]。前期研究显示依达拉奉治疗大鼠心肌重构与调控血管紧张素Ⅱ1 型受体（angiotensinⅡtype 1 receptor，AT1R）/丝裂原活化蛋白激酶信号通路有关[12-14]。类固醇激素合成急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）是AT1R 发挥作用的中间蛋白，其易化胆固醇穿过线粒体外膜最终合成醛固酮从而激活MR。本研究旨在探究依达拉奉治疗小鼠压力超负荷致心肌重构形成是否与抑制AT1R/StAR/MR 激活有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

本研究符合山西省人民医院伦理委员会要求（2020 省医科伦审字第140 号）。18 只4 周龄SPF 级C57 小鼠，体重22～24 g，购自山西省人民医院实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（晋）2019-0001，使用许可证号：SYXK（晋）2019-0003。饲养于标准SPF级环境4 周，期间自由摄食、饮水。将小鼠按随机数字表法分为3 组：对照组、血管紧张素Ⅱ组、依达拉奉组，每组6 只。

1.2 心脏压力超负荷模型的建立

腹腔注射氯胺酮200 mg/kg 麻醉后，俯卧位置于操作台上。参照文献[15-16]，在肩胛间区下缘备皮消毒，2 cm 横切口，用止血钳皮下钝性分离形成囊袋，血管紧张素Ⅱ组、依达拉奉组小鼠埋置预先充填血管紧张素Ⅱ的渗透泵，对照组小鼠埋置预先充填0.9%氯化钠的渗透泵，然后用手术丝线缝合切口。

1.3 给药方法

埋置渗透泵后，依达拉奉组给予依达拉奉腹腔注射（批号：2019031，吉林博大制药有限公司）10 mg/（kg·d），连续28 d[13，15，17]。

1.4 称重及取材

造模成功后，小鼠称重并记录。于异氟烷麻醉后，眼球采血后处死小鼠，剪下心脏，生理盐水灌洗心腔，冲洗心腔内残余血液后称重并记录，计算心重/体重（heart weight/body weight，HW/BW）比值。之后将其石蜡包埋。

1.5 心肌细胞横截面积的测定

苏木精-伊红染色步骤：石蜡切片脱蜡，苏木精染色，伊红染色与脱水，乙醇和二甲苯透明，滴上中性树胶，盖上盖玻片。每张切片由2 名工作人员随机选取10 个有明显细胞核和完整细胞膜的心肌细胞进行测定，Image J 软件测量心肌细胞横截面积（cross sectional area of myocardial cells，MSA）。

1.6 Masson’s 染色法测定胶原容积分数

石蜡切片常规脱蜡至水，依次在苏木精染色液、丽春红品红染色液、磷钼酸液、苯胺蓝液、弱酸溶液冲洗后乙醇脱水、中性树胶封固。每张切片由2 名工作人员随机选取高倍镜下的3 个视野，胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）＝蓝色面积/总面积×100%。

1.7 免疫组织化学染色法测定心肌组织AT1R、StAR、转化因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）、α-平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin，α-SMA）、MR表达

石蜡切片常规脱蜡至水，抗原修复后，室温孵育10 min，PBS 冲洗后，滴加一抗。AT1R 抗体（批号：BA0582，索莱宝生物科技有限公司，中国，1∶200）；StAR 抗体（批号：A16432，索莱宝生物科技有限公司，中国，1∶200），TGF-β1抗体（批号：BM3901，索莱宝生物科技有限公司，中国，1∶100）；α-SMA 抗体（批号：BM3902，索莱宝生物科技有限公司，中国，1∶50）；MR 抗体（批号：A3308，索莱宝生物科技有限公司，中国，1∶100），4℃过夜，次日PBS 冲洗，滴加二抗羊抗鼠抗体（批号：PV-9001，中杉金桥生物技术有限公司，中国）孵育30 min，PBS 冲洗，DBA 染色，苏木精复染、封片。阳性染色为黄色或深褐色，每张切片2 名工作人员随机选取高倍镜下的3 个视野，切片扫描仪扫描后，采用Image-Pro Plus 6.0 软件测定累计光密度值和区域面积，计算平均光密度值。

1.8 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠HW/BW 比值、MSA 和CVF 比较

血管紧张素Ⅱ组小鼠HW/BW 比值、MSA 和CVF高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；依达拉奉组小鼠HW/BW 比值、MSA 和CVF 低于血管紧张素Ⅱ组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠HW/BW 比值、心肌细胞横截面积和胶原容积分数比较（±s）

表1 各组小鼠HW/BW 比值、心肌细胞横截面积和胶原容积分数比较（±s）

注 与对照组比较，aP＜0.05；与血管紧张素Ⅱ组比较，bP＜0.05。HW/BW：心重/体重比值；MSA：心肌细胞横截面积；CVF：胶原容积分数。

2.2 各组小鼠TGF-β1、α-SMA、MR、StAR 和AT1R表达比较

血管紧张素Ⅱ组小鼠TGF-β1、α-SMA、MR、StAR、AT1R 蛋白表达高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；依达拉奉组小鼠的TGF-β1、α-SMA、MR、StAR、AT1R 蛋白表达低于血管紧张素Ⅱ组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠TGF-β1、α-SMA、MR、StAR 和AT1R 表达比较（±s）

表2 各组小鼠TGF-β1、α-SMA、MR、StAR 和AT1R 表达比较（±s）

注 与对照组比较，aP＜0.05；与血管紧张素Ⅱ组比较，bP＜0.05。TGF-β1：转化生长因子-β1；α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白；MR：盐皮质激素受体；StAR：类固醇合成急性调节蛋白；AT1R：血管紧张素1 型受体。

3 讨论

心肌重构是心脏应对压力超负荷的代偿机制，其特征表现为心脏质量增大、细胞肥大和相关蛋白增多[18]。长期压力超负荷引起心肌舒张和收缩功能障碍最终导致心力衰竭[19]。目前治疗心力衰竭的药物有β 受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂和AT1R 阻滞剂，但心血管疾病病死率仍显著增加[3]。因此，进一步了解心肌重构发生发展的生物学机制意义重大。本研究采用皮下埋置渗透泵持续灌注血管紧张素Ⅱ的方法复制小鼠压力超负荷模型[16，20]。研究表明[21-22]，血管紧张素Ⅱ组小鼠HW/BW 比值、MSA、CVF 高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示小鼠心肌肥厚、胶原蛋白沉积增加、心脏纤维化形成进而心脏衰竭发生，结合本研究结果提示小鼠心肌重构模型制备成功。

小鼠埋置渗透泵后，血管紧张素Ⅱ与心肌和血管平滑肌上AT1R 结合，激活下游StAR 后易化胆固醇从线粒体外膜穿入，在细胞色素P450 侧链裂解酶作用下转化为孕烯酮，接着生成脱氧皮质酮最终合成醛固酮，醛固酮与MR 结合后使其转位到细胞核发挥促高血压、心肌重构和炎症作用[23-25]。血管紧张素Ⅱ和醛固酮又介导炎症细胞如单核细胞、巨噬细胞在心脏组织内增殖，从血管迁移到组织间隙，大量巨噬细胞产生TGF-β，促使心脏成纤维细胞分化为生成α-SMA的肌成纤维细胞，后者生成细胞外基质如胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ的能力是成纤维细胞数倍，从而导致细胞外基质过度堆积，心肌重构加重[26-27]。

本研究结果显示，血管紧张素Ⅱ组小鼠的HW/BW比值、MSA 和CVF 高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示依达拉奉可抑制小鼠压力超负荷致心肌重构。血管紧张素Ⅱ组小鼠心肌细胞的AT1R、StAR和MR 蛋白表达高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；依达拉奉组小鼠心肌细胞的AT1R、StAR 和MR 蛋白表达低于血管紧张素Ⅱ组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示依达拉奉治疗小鼠压力超负荷致心肌重构与抑制AT1R/StAR/MR 有关。李开智等[28]研究表明，依达拉奉通过调控PI3K/Akt 信号通路改善大鼠心脏功能，与本研究结果一致，但目前缺乏依达拉奉抑制AT1R/StAR/MR 信号通路的相关报道，这是此研究的创新点。

鉴于治疗心力衰竭没有确切的有效方法，本研究有望为该药的临床推广提供重要理论依据，可以与β 受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂或AT1R 阻滞剂联合用于心力衰竭患者的治疗，以防止心功能障碍的进展。目前缺乏依达拉奉治疗心肌重构的最佳剂量数据，此外其潜在机制有待完全阐明，这是未来探索的方向。

综上所述，依达拉奉可抑制小鼠压力超负荷致心肌重构形成，其机制与抑制AT1R/StAR/MR 信号通路激活有关。