FSHR基因多态性在颗粒细胞中的表达与卵巢储备功能及妊娠结局的相关研究

李淑芳，刘芳，赵杰，薛聿婷，席静，付文慧

(1.内蒙古医科大学,呼和浩特 010050;2.内蒙古医科大学附属医院生殖医学中心,呼和浩特 010050)

近年来因卵巢储备功能异常行辅助生殖技术(ART)助孕的比例呈现上升趋势[1]。卵巢储备功能影响因素十分复杂,包括年龄、遗传因素、环境危害、盆腔手术、免疫因素等。有研究报道,一些单核苷酸多态性(SNP)位点变异可能与卵巢储备差异相关,在辅助生殖过程中应该考虑这些SNP位点变异对于卵巢功能的影响[2]。为此本研究选择FSHR-rs6166基因探究基因多态性在颗粒细胞中的表达以及与卵巢储备功能、妊娠结局及卵巢反应性的相关性。

资料与方法

一、研究对象

选取2020年9月至2022年10月就诊于内蒙古医科大学附属医院生殖医学中心实施ART助孕治疗的不孕症患者为研究对象。

纳入标准:(1)20～40岁女性;(2)染色体及核型正常;(3)无盆腔手术史;(4)近3月未使用任何激素类药物;(5)既往无盆腹腔放化疗病史;(6)无其他内分泌疾病。

排除标准:(1)未能按计划进入周期;(2)男方精子检测异常者;(3)供精供卵助孕者;(4)胚胎植入前遗传学检测(PGT)助孕。

本研究共纳入103例患者,研究设计经内蒙古医科大学附属医院伦理委员会批准(伦审号:2017医012),所有研究对象均签署知情同意书。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COH):所有入组者进入ART周期,采用常规黄体期短效长方案进行COH。选用促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)短效制剂(达菲林,辉凌,德国) 0.1 mg/d,降调节达标准后启动促性腺激素(Gn),B超监测卵泡发育状况对Gn量进行调整,在卵泡成熟后停用Gn,肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(HCG,珠海丽珠)8 000～10 000 U,36 h后在B超引导下经阴道穿刺取卵。IVF受精,胚胎培养3 d,选取评分Ⅰ-Ⅱ级胚胎移植2枚。

2.颗粒细胞的提取:在净化后的操作台内将剩余卵泡液放入离心管中,2 300 r/min离心15 min,去掉上清液,加入3～5倍细胞体积的红细胞裂解液,轻轻吹打混匀,裂解1～2 min,以2 300 r/min再离心5 min,去掉红色上清液;若沉淀仍有肉眼可见红色,重复裂解一次,加入5～8倍细胞体积的PBS缓冲液并清洗细胞,2 300 r/min离心5 min,弃掉上清液,加入适量细胞冻存液,转入-80℃冰箱中冷冻保存。

3.荧光定量PCR检测FSHR-rs6166:将冻存的颗粒细胞解冻后,用Trizol法提取颗粒细胞总RNA,紫外分光光度计检测RNA浓度,进行反转录、荧光定量PCR扩增。引物序列为如下:FSHR-rs6166 Forword 引物序列5’到3’TTTGTGGTCATCTGTGGCTGC,Reverse引物序列5’到3’ CAAAGGCAAGGACTGAATTATCATT。反应体系如下:模板2 μl,引物1(10 μmol/L) 2 μl,引物2(10 μmol/L) 2 μl,2×反应混合物25 μl,双蒸水50 μl。反应条件为:94℃预变性3 min,94℃30 s,55℃30 s,72℃45 s,共30个循环,终末72℃延伸5 min。

4.琼脂凝胶电泳检测、回收及测序:PCR反应结束后,使用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物,观察显影结果并照相。将PCP所得扩增产物行胶回收,将胶回收纯化的PCR产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行一代测序。将测序结果利用SnapeGene软件与原序列进行比对分析,确定是否突变,并统计基因型。

三、数据采集及判断标准

1.患者基本资料收集:年龄、不孕年限、体质量指数(BMI)、基础卵泡刺激素(bFSH);患者进入周期后该周期内Gn启动剂量、Gn天数、Gn总量、HCG日E2水平、HCG日内膜厚度、获卵数、卵巢反应性、MⅡ卵数、2PN数、受精卵数、卵裂数、可移植胚胎数、优质胚胎数、移植周期数、妊娠结局。

2.临床妊娠判定标准:胚胎移植后14 d行血清β-HCG检测,阳性者(HCG≥5 U/L)于移植后28 d行阴道超声检查示妊娠囊及心管搏动者,确定为临床妊娠。

3.卵巢反应性[3]:获卵数≤4枚者为卵巢低反应;获卵数为5～14枚者为卵巢正常反应;获卵数为≥15枚者为卵巢高反应。

四、统计学分析

结 果

一、PCR琼脂凝胶电泳、测序结果

PCR扩增产物的琼脂糖凝胶图显示,FSHR-rs6166 SNP基因型所对应的条带长度在108～521 bp之间,有三种类型(表1和图1)。扩增产物回收纯化测序,基因型分别为AA、AG和GG(图2)。

图1 FSHR-rs6166 PCR扩增产物电泳图

图2 FSHR-rs6166 PCR扩增产物基因测序结果

表1 FSHR-rs6166 SNP基因型条带情况

二、FSHR-rs6166基因多态性分布

研究103例行ART女性的FSHR-rs6166基因型与等位基因情况,其分布情况如表2所示。运用Haploview软件对位点FSHR基因的SNP位点进行Hardy-Weinberg平衡检验。两个位点的基因型在研究对象中的分布(χ2=0.897,P=0.344)符合Hardy-Weinberg平衡定律,达到了遗传平衡,具有群体代表性。

表2 FSHR-rs6166 SNP位点的基因型及等位基因频率分布[n(%)]

三、3组FSHR-rs6166基因型患者的一般资料

FSHR-rs6166位点上3组基因型患者间的年龄、BMI、不孕年限差异均无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表3 三组FSHR-rs6166基因型患者间的一般资料比较(-±s)

四、FSHR-rs6166不同基因型患者间的卵巢储备功能

GG组及AG组的bFSH值显著高于AA组(P=0.003),AA组的AMH显著高于GG组及AG组(P=0.036);3组基因型患者间的AFC差异虽然无统计学意义(P>0.05),但在数值上GG组的AFC低于AG组及AA组(表4)。

表4 三组FSHR-rs6166 基因型间卵巢储备功能指标比较(-±s)

五、3组FSHR-rs6166基因型患者的临床及实验室指标

3组患者的Gn启动量、Gn总量、Gn天数、HCG日E2、获卵数、MⅡ卵数、2PN数、卵裂数差异均无统计学意义(P>0.05),但GG组的Gn总量、Gn天数高于AG组及AA组,且GG组的HCG日E2水平、获卵数MⅡ卵数、2PN数、卵裂数低于AG组及AA组(表5、表6)。

表5 三组FSHR-rs6166基因型患者间的临床指标比较(-±s)

表6 三组FSHR-rs6166基因型患者间的实验室指标比较(-±s)

六、3组FSHR-rs6166基因型患者的ART结局

统计结果显示,3组患者间的受精率、优质胚胎率、临床妊娠率、活产率差异均无统计学意义(P>0.05)(表7)。

表7 FSHR-rs6166 3组基因型间ART结局相关指标比较(%)

七、3组FSHR-rs6166基因型患者的卵巢反应性

3组患者促排卵后出现卵巢高反应、正常反应及低反应的比例差异无统计学意义(P>0.05)(表8)。

表8 FSHR-rs6166 3组基因型患者卵巢反应性比较[(n)%]

讨 论

FSH由垂体分泌,通过与卵巢颗粒细胞上的FSHR结合促进卵泡颗粒细胞增殖分化,从而促进卵泡发育与成熟,所以FSHR基因的稳定性决定了FSH的功能。FSHR基因包含10个外显子和9个内含子,大多数研究集中在FSHR的单核苷酸多态性在第10外显子的替换上。该基因细胞内域的680位密码子碱基G代替A,会有三种基因型:野生型AA基因型、突变型GG基因型、杂合子型AG基因型。本研究选入的103例ART助孕女性中,FSHR-rs6166 野生型AA基因型是最常见的基因型,频率为49.5%,这与国内李路等[4]的研究结果相似。国外学者的相关研究示,AG基因型是荷兰、日本人群中最常见的基因型[5-6],这说明FSHR多态性的分布差异可能与地域有关。

一、FSHR-rs6166基因多态性对卵巢储备功能的影响

卵巢储备功能即卵巢内的卵泡生长、发育、形成可受精卵母细胞的能力,包括卵巢内存留的卵泡数量及质量两方面[7]。目前,在ART助孕过程中,主要通过FSH、AMH、AFC等评估卵巢储备功能及预测获卵数。近年来研究显示:FSHR的基因突变影响女性的生育力[8]。Aittomaki等[9]最早提出卵巢储备功能与FSHR受体的突变相关,颜元良等[10]进一步证实FSHR-rs6166位点突变型GG基因型可能与女性卵巢储备功能下降相关。本研究中,FSHR-rs6166 GG组患者的bFSH值显著高于AA组(P<0.05),GG组的AMH显著低于AA组(P<0.05);虽然3组患者的 AFC差异无统计学意义,但在数值上GG组的AFC低于AA组。结果提示FSHR-rs6166 突变型GG基因型患者的卵巢储备功能较AA基因型低下。分析FSHR基因突变影响其功能的原因主要包含以下3个方面:(1)突变体所表达的FSHR并未大量正常表达于细胞膜上而是聚集于细胞质内部,降低FSHR转运至细胞表面的能力,影响与配体FSH的结合力;(2)抑制腺苷酸环化酶的活性,影响第二信使cAMP产生,从而抑制信号转导;(3)突变使编码FSHR的氨基酸发生改变,阻碍FSHR的翻译过程,FSHR蛋白生成减少,可能使颗粒细胞对FSH反应不良[11]。

二、FSHR-rs6166基因多态性对卵巢反应性的影响

在COH过程中,卵巢对外源性Gn的反应直接影响到Gn用量、HCG日E2水平、获得卵母细胞的数量及质量。目前,FSHR基因多态性与卵巢反应性的关联被人们关注[12],但国内外对FSHR-rs616基因多态性对卵巢反应性的研究结果不完全相同。一些研究[13-15]表明GG基因型的患者易发生卵巢低反应,而Mohiyiddeen等[16]表明FSHR-rs6166基因型与卵巢反应性无关。本研究中,3组基因型患者发生卵巢高、正常及低反应的差异无统计学意义(P>0.05)。虽然3组基因型Gn启动量、Gn总量、Gn天数、HCG日E2水平差异无统计学意义(P>0.05),但在数值上GG组的Gn总量、Gn天数高于AG组及AA组,且GG组的HCG日E2水平、获卵数低于AG组及AA组。这可能是因为突变型GG基因型的患者卵巢储备功能降低,所以在COH过程中会因卵泡生长缓慢或卵泡数量少而增加Gn总量和延长给药时间,同时获卵数及HCG日E2水平也低于AG组及AA组。因此,对于卵巢储备功能低下高危人群,根据基因位点的检测结果,在未发生卵巢储备功能降低前适当提早进入ART周期,或在进入ART周期后选择个体化的促排卵方案以缩短Gn使用时间及降低Gn用量,这样不仅能让患者尽早妊娠而且减少了患者心理负担及经济负担。

三、FSHR-rs6166基因多态性对ART结局的影响

现有研究对FSHR-rs6166基因多态性对ART结局的影响也不一致:Jun等[17]研究结果发现,GG基因型的受精率、胚胎移植率及临床妊娠率高于AA及AG基因型;Mohammad等[18]研究表明AA基因型的临床妊娠率高于AG及GG基因型;而Dimitris等[19]研究结果显示,3组基因型临床妊娠率无差异;König等[20]研究指出,3组基因型与活产率无关。本研究中,FSHR-rs6166不同基因型在MⅡ卵数、2PN数、卵裂数、受精率、优质胚胎率、临床妊娠率、活产率差异无统计学意义(P>0.05),这与Dimitris等[19]、马卓群等[15]的研究一致,原因可能是ART助孕过程中妊娠结局由众多因素所决定,包括年龄、卵巢储备功能、子宫内膜的容受性、胚胎的质量及环境因素等决定,而非单一因素决定。

综上所述,FSHR-rs6166基因的多态性与卵巢储备功能相关,突变型GG基因型患者卵巢储备功能相对低下,因此在进行ART前对FSHR基因多态性进行检测,依据不同的基因型制定个体化促排卵方案,减少患者及其家庭精神与经济负担,对临床工作有一定意义。但基因多态性对妊娠结局、能否预测卵巢反应性的影响并不明显,还需要通过大样本的实验进一步研究。