基于简化基因组测序揭示水角的濒危机制

吴欣仪 王蒙 郑希龙 张锐 何松 严岳鸿

摘要：物种的遗传多样性是决定物种适应性和生存能力的关键因素。生境片段化是造成生物多样性丧失的重要因素之一，对植物种群的遗传多样性有着重要影响。水角（Hydrocera triflora）作为一种濒危植物，其遗传多样性状况和濒危机制尚未有报道。该文收集了水角7个种群共计34个样本，利用简化基因组测序技术（RAD-seq）获得了单核苷酸变异位点（SNP）。通过种群遗传多样性和遗传结构的分析，并结合种群历史动态分析和不同气候情景下物种潜在分布区预测，探讨了水角的濒危机制。结果表明：（1）水角遗传多样性较低（Ho=0.156 9、He=0.165 4、π=0.186 5），遗传分化系数较高；AMOVA分析表明，遗传变异主要发生在种群内。（2）Mantel检测表明环境距离与遗传距离、地理距离均呈显著正相关，分别为P=0.041 2和P=0.008 2。（3）水角的有效种群大小从全新世中期开始持续下降，与琼北火山群的喷发时间一致。（4）与当代气候相比，虽然在未来气候变化下水角的潜在分布区总面积变动不大，但在高CO2排放的情景下，大量的高適生区将会丧失并转化为低适生区，特别是位于马来群岛的适生区几乎完全消失。该研究结果表明，生境片段化导致了水角较低的遗传多样性和有效种群大小的持续下降。因此，自身更新能力低以及人为活动干扰、城市化等不利的环境条件是导致其濒危的主要原因。建议加强对水角的就地保护，采用人工授粉等方法提高其基因流以增加其种群的遗传多样性，同时，要着重保护湿地免遭破坏。

关键词： 生境片段化， 简化基因组测序， 遗传多样性， 遗传结构， 物种分布模型， 种群历史动态

中图分类号：Q943    文献标识码：A    文章编号：1000-3142（2023）08-1414-14

RAD-seq revealed the endangered mechanism of Hydrocera triflora （Balsaminaceae）

WU Xinyi1， WANG Meng1， ZHENG Xilong2， ZHANG Rui3， HE Song4， YAN Yuehong1*

（ 1. Orchid Conservation & Research Center of Shenzhen / National Orchid Conservation Center of China， Shenzhen Key Laboratory for Orchid Conservation and Utilization， Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration for Orchid Conservation and Utilization， Shenzhen 518114， Guangdong， China; 2. School of Traditional Chinese Medicine Resources， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 3. Shanghai Chenshan Plant Science Research Center， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201602， China; 4. Haikou Wetland Protection and Management Center， Haikou 570135， China ）

Abstract：The genetic diversity of species is a key factor in their adaptability and survival capability. Habitat fragmentation is recognized as one of the key factors causing biodiversity loss， and it has significant impacts on the genetic diversity of plant populations. Hydrocera triflora is an endangered species. Its genetic diversity is unclear and endangered mechanism has not been reported. In this study， 34 samples of H. triflora from seven populations were used to obtain single-nucleotide polymorphisms （SNP） by Restriction-site Associated DNA sequencing （RAD-seq）. We discussed the endangered mechanisms of H. triflora by analyzing population genetic diversity and structure. Additionally， we combined these results with historical population dynamics analysis and predictions of potential species distribution in different climate scenarios. The results were as follows： （1） H. triflora had low genetic diversity （Ho=0.156 9， He=0.165 4， π=0.186 5） and high genetic differentiation coefficient; AMOVA analysis showed that genetic variation mainly occurred within populations. （2） The Mantel test indicated that there was a significant positive correlation between environmental distance and genetic distance， as well as geographical distance， with respective P-values of 0.041 2 and 0.008 2. （3） The effective population size of H. triflora had been continuously declining since the mid-Holocene.（4） The total potential distribution area of H. triflora change slightly in the future compared to that in the modern climate. However， in scenarios of high CO2 emissions， the high suitable area decreased significantly and changed into low suitable area， especially in the Malay Islands where the suitable habitat was almost to extinction. The results indicate that habitat fragmentation caused a sustaineddecrease in the genetic diversity and effective population size of H. triflora. Therefore， the low self-renewal capacity， as well as detrimental environmental conditions such as human disturbance and urbanization， are the primary factors contributing to its endangered state. It is recommended to strengthen the in-situ protection of H. triflora， employing techniques such as artificial pollination to enhance gene flow among populations and thereby increase genetic diversity， and at the same time， we should focus on protecting wetlands from destruction.

Key words： habitat fragmentation， Restriction-site Associated DNA sequencing （RAD-seq）， genetic diversity， genetic structure， species distribution models， demographic history

保护基因组学（conservation genomics）广义上是指将基因组技术和方法应用于保护生物多样性和物种保护工作中的一门学科（Allendorf et al.， 2010），主要聚焦于物种的濒危机制与保护策略研究。评估物种的遗传多样性水平及其在个体和群体中的分布格局是对该物种保护遗传研究的重要内容（Hamrick & Godt，1996）。分子遗传标记是评价种质资源遗传多样性的重要工具，推动保护遗传学的发展。虽然遗传信息早已运用在濒危物种的研究中，但是全基因组范围的大量信息标记却是最近20年才开始使用（Supple & Shapiro， 2018），最初也只是应用在少数的模式植物中。

高通量测序技术（high-throughput sequencing）的飞速发展催生了简化基因组测序技术。简化基因组测序（Restriction-site Associated DNA sequencing，RAD-seq）是一种常见的简化基因组技术，通过测序限制性酶切位点附近的短片段，具有覆盖度较高、测序成本低等优点。它不受参考基因组的限制，能获得大量的高质量信息位点（single-nucleotide polymorphisms， SNP）（Davey et al.， 2011；Narum et al.， 2013）。目前，RAD-seq已广泛应用于群体研究与分子育种等领域，包括分子标记开发、群体遗传分析、遗传图谱构建和全基因组关联分析等。孙维悦等（2022）通过简化基因组测序对濒危植物荷叶铁线蕨（Adiantum nelumboides）的保护基因组学研究，揭示了其濒危机制。Cai等（2021）对具有重要经济价值的热带雨林树种滇南风吹楠（Horsfieldia tetratepala）进行RAD-seq测序，制定了更有效的保护策略。曹毓蓉等（2022）利用RAD-seq对极危物种波叶杜鹃（Rhododendron hemsleyanum）的遗传特征进行无参考基因组分析，证明对于无参考基因组的极小种群野生植物（plant species with extremely small populations， PSESP）也可用简化基因组测序手段获取SNP分子标记。因此，相信针对无参考基因组的濒危物种，简化基因组测序可以获得充足的遗传信息，为保护基因组学研究提供有效工具。此外，有效种群大小的估计对于保护和管理濒危物种、了解种群动态以及预测遗传演化的方向和速度非常重要。种群历史动态是保护基因组学的重要研究内容（Girod et al.， 2011）。在种群的演化过程中，气候变化和地质事件作为重要的外部作用力对种群的动态变化起着关键作用。

除了物种的自身特征、气候历史等因素影响遗传多样性以外，生境片段化也是造成生物多样性丧失的重要因素之一（Wilcove et al.，1998）。生境片段化不仅会导致遗传多样性降低、近交自交衰退、基因流减少和种群规模减小等（Young et al.， 1996；陈小勇，2000；Honnay & Jacquemyn， 2007），还会造成物种栖息地减少，影响传粉者数量，降低传粉率和繁殖成功率，从而影响物种的多样性（Aguilar et al.， 2006；González-Varo et al.， 2009）。生境片段化是指原先连续的生境被分割成不同规模和形状的片段而形成的新的生境格局（Wilcove & Mclellan， 1986）。目前，大部分的研究表明生境片段化对遗传多样性产生的负效应多于正效应（武晶和刘志民，2014）。在以专性传粉的石竹（Dianthus deltoides）研究中，发现片段化生境的石竹其种子结实率低并可能产生自交种子而进一步降低其种群的遗传多样性（Jennersten， 1988）。濒危植物Bankia goodii受生境片段化影响，其路边的物种个体繁殖力降低（Lamont et al.， 1993）。因此，当濒危物种遭受生境片段化影响时，应进一步加强研究，以更好地理解生境片段化如何影响植物遗传多样性，揭示其濒危机制并提出有效的保护策略。

水角（Hydrocera triflora）系凤仙花科（Balsaminaceae）水角属（Hydrocera）多年生水生草本植物，产自中国（海南）、印度、斯里兰卡、泰国、越南、老挝、柬埔寨、马来西亚及印度尼西亚。喜生于湖边、沼泽湿地或水稻田中。对海南省水角资源现状的调查发现，随着农村旅游的开发建设，水体被改造，湿地被大量开发利用，水角生境受到不同程度的破坏，该种分布范围越来越狭窄，十分罕见（王景飞等，2017）。在《中国生物多样性红色名录——高等植物卷（2020）》评估报告中，水角处于濒危（EN）等级。有关水角的相关研究较少，2014年中国科学院昆明植物研究所在海口地区重新发现了该种植物，这是30多年来该物种在国内再次被发现。水角属和凤仙花属（Impatiens）的花发育揭示了凤仙花科最早期分化谱系的进化趋势，花序从简单的轴生花序渐进转变成更复杂的腋生花序以及花被片的分化是一个渐进的过程（Janssens et al.， 2012）。水角属作为凤仙花科的单种属，研究其遗传多样性不仅可以评估生境片段化对遗传多样性的影响，同时也为凤仙花科的进化和系统分类提供基础数据。

本研究以来自海口地区7个种群的34个水角个体为实验材料，通过RAD-seq简化基因組测序技术，进行群体遗传分析，以探明以下内容：（1）基因组水平下水角的遗传多样性和遗传结构；（2）水角有效种群大小的历史变化；（3）不同气候情景下水角的潜在分布区变化。以期为水角种质资源的保护利用、育种策略的实施提供理论依据。

1材料与方法

1.1 实验材料

对分布在海口市的水角进行野外采集（图1），共收集到7个种群合计34个样本。每个种群均有一份凭证标本，存放于深圳市兰科植物保护研究中心标本馆（CNOCC）。每个种群具体信息见表1。

1.2 DNA提取和RAD文库构建

本研究利用天根植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）进行适当改良后对所有样品的基因组DNA进行提取。通过琼脂糖凝胶电泳和Qubit浓度检测后，送至上海元莘生物医药科技有限公司测序。采用EcoR I限制性内切酶进行酶切后构建长度范围在300～500 bp的双端测序文库。纯化后的文库在Illumina Novoseq 6000测序平台完成该物种简化基因组测序。

1.3 获取单核苷酸多态性（SNP）

在测序数据下机后，利用FastQC软件进行质控，包括去除接头、poly_A和低质量的数据，最后得到高质量的数据（clean data），用于后续的分析。本研究利用Stacks v2.54软件（Catchen et al.， 2013）对水角的RAD-seq数据进行无参De Novo组装和变异检测。分别运行Stacks软件内的process_radtags对样本进行过滤，除去不含RAD标签的序列。使用ustacks对每个样本建立位点，设置控制错配数的参数M为3，每个等位基因所需的最小片段数m为3；运行cstacks程序构建包含所有位点信息的catalog目录文件，设置位点间允许的错配数n为3；运行sstacks程序把每个样本比对到创建的目录上；通过tsv2bam、gstacks以及population程序得到包含75 209个SNPs位点的vcf文件。为保证下游分析的可靠性，使用VCFtools v0.1.13软件（Danecek et al.， 2011）对Stacks软件中检测出的SNPs进一步过滤。设置--max-missing 0.9，即最大缺失率为90%；--maf 0.05，将最小等位基因频率设置为0.05；--minDP 5，确保基因型最小深度为5。过滤后剩下高质量的38 667个SNPs用于后续群体遗传结构的分析。

1.4 群體结构分析

基于34个水角样品的SNPs位点，运行vcf2phylip脚本构建个体间的遗传距离矩阵，利用IQ_TREE v1.6.9软件（Nguyen et al.， 2015）使用最大似然法（maximum likelihood， ML）进行系统树的构建。根据1 000次重复的快速自展（ultrafast bootstrap， UFBoot）（Minh et al.， 2013）和SH-aLRT（Guindon et al.， 2010）测试进化枝，得到最终的系统发育树。利用FigTree v1.4.3软件（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/gtree/）可视化和编辑生成的树文件。

将之前获得的高质量的SNP数据集使用VCFtools软件转换成ped和map文件后进行过滤生成bed文件，用Admixture（Alexander et al.， 2009）基于每个个体的基因型推断个体祖先成分，模拟在亚群数K值为2到7情况下的分群情况，根据不同K值模拟下的最小交叉验证（cross validation， CV）获得最佳分群数。

使用GCTA v1.26.0软件（https：//yanglab.westlake.edu.cn/software/gcta/）生成用于PCA分析的矩阵，用R语言中的ggplot2软件包绘制主成分分析的结果图。

1.5 群体遗传多样性分析

通过Stacks软件中的Populations子程序计算物种水平的近交系数（inbreeding coefficient，FIS），观察杂合度（observed heterozygosity， Ho），期望杂合度（expected heterozygosity， He）。同时基于所有（变异和非变异）位点计算核苷酸多态性（nucleotide diversity， π）等遗传参数。再用R语言的GroupGenome v2.6.1程序包（Pfeifer et al.， 2014）计算种群间遗传分化系数（genetic differentiation among populations， FST），衡量群体间遗传分化水平。

1.6 Mantel相关性检验和分子方差分析

为了评估7个水角种群的遗传距离、地理距离以及环境距离之间的相关性，利用R软件中的“raster”和“rgdal”提取每个种群点的气候信息，构建19个环境因子的环境距离矩阵，用“geosphere”构建地理距离的矩阵，利用“ape”读取遗传距离矩阵，用“ade4”对两两矩阵进行9 999次的Mantel重复检验，利用“ggplot”进行Mantel检验结果的绘图。此外，利用Arlequin 3.5软件（Excoffier & Lischer， 2010）进行分子方差分析（analysis of molecular variance， AMOVA）。AMOVA 基于进化距离（evolutionary distance）来度量并计算单倍型（含等位基因）或基因型间的方差（δ2），计算组间遗传分化系数（genetic differentiation among groups， FCT），推断群体不同遗传组分之间的变异水平。

1.7 种群历史动态分析

基于SMC模拟种群历史动态的方法是高度依赖于完整基因组上的重组图谱，并不适用于无参考基因组的物种（Li & Durbin， 2011）。而基于点位频谱（site frequency spectum，SFS）的方法不依赖于位点之间的连锁或连续性（Gutenkunst et al.， 2009），并且对近期的种群历史大小变化有较高的分辨率（Liu & Fu， 2015; Lapierre et al.， 2017）。因此，将所获得的SNP数据使用基于SFS的Stairway Plot v2（Liu & Fu， 2020）推测水角在100 kya～1 kya（thousand years ago）间的Ne变化。生成无缺失且无连锁不平衡（linkage disequilibrium， LD）的SNP数据集，将VCF文件用python脚本easySFS（https：//github.com/isaacovercast/easySFS）建立一维（one-dimensional， 1D）SFS。将SFS状态指定为folded，以统计次等位基因的SFS。选择使位点数尽量多的projection值输出SFS信息，将SFS信息输入Stairway Plot v2运行所需的blueprint文件中。突变率设置为1.0×10-8，2年为一代，200次自展检验用于计算Ne中位数及95%置信区间。结果在R语言中可视化。

1.8 潜在分布区预测

根据材料采集，分布点通过GPS实地定位以及中国数字植物标本馆（http：//www.cvh.org.cn/）和全球生物多样性信息网络（https：//www.gbif.org/）等相关数据库获取标本采集地经纬度信息，共收集到东南亚水角坐标信息200余个。对所有数据按照MaxEnt模型（http：//biodiversity informatics.amnh.org/open_source/maxent）要求进行标准化处理， 并且为了防止在进行最大熵模型分析时出现过拟合现象，将水角的分布数据进行筛选，在50 km2内的分布点仅保留1个，共计得到29个具有经纬度信息的水角分布点并整理生成CSV文件。

从全球气候数据库WorldClim 2.1（http：//www.worldclim.org）分别下载全新世中期（mid-Holocene， MID; 约6 000年前）、当代（1970—2000年）和未来（2081—2100年）的19个生物气候变量，数据空间分辨率为2.5 min（5 k分辨率）。未来气候情景选择CMIP6中SSP1-2.6和SSP5-8.5（shared socioeconomic pathway，SSP）的两组数据，分别表示年平均温度上升1.4～1.8 ℃和4.4～4.8 ℃。

运行MaxEnt软件模拟水角在不同气候情景下的潜在分布格局，设置训练集为75%，测试集为25%进行模拟分析。将物种分布数据与气候环境数据一起导入MaxEnt中，选择刀切法（Jackknife）模型迭代500次，计算各环境变量对物种分布格局的贡献率，绘制响应曲线并制作预测图。加载到ArcGIS 10.2中，提取东南亚区域，根据生境适宜度指数（habitat suitability index， HSI），划分为四个等级。其中，HSI≤0.1为非适生区；0.1<HSI≤0.3為低适生区；0.3<HSI≤0.5中适生区；HSI>0.5为高适生区。采用ROC曲线评价预测模型的准确性，同时根据气候因子的贡献率判断影响物种分布的主导环境因子。

2结果与分析

2.1 测序数据概况

本研究利用RAD简化基因组技术对34个水角样本进行测序，测序结果以FASTQ（简称fq）格式储存，包含了测序的序列信息和其对应的测序质量信息。经过质量评估和过滤后，共获得37.91 Gb的clean data数据，平均每个样本为1.12 Gb。每个样本的reads读长在2 512 919到55 093 740，其中GC含量均值为36.2%，所有样本的Q30均值为92.9%，表明测序质量较高，达到后续分析的要求。使用Stacks进行无参考基因组分析后，得到水角34个样本的平均位点数为68 226，平均片段覆盖深度为8.61 X。经过VCFtools再次过滤后，最终获得38 667个高密度的SNP位点。

2.2 群体遗传结果分析

进行Structure分析发现，当K=3时，CV值最小（图2：A），说明34个个体可分为3个遗传聚类（图2：B）。利用最大似然法（ML）基于38 667个SNPs位点对34个样本构建的系统进化树表明（图2：C），每个种群的个体都能聚在同一个遗传分支上，并具有100%的支持率。昌旺溪（CWC）、卜茂村（BMC）、东兴村（DXC）的遗传结构更相似为一组（Cluster 1）；卜壁村（BBC）、卜史村（BSC）、文选村2（WXC2）的遗传结构显示出更近的亲缘关系，倾向于另一组（Cluster 2）；文选村1（WXC1）表现出与其他种群不一样的遗传结构，为Cluster 3。主成分分析（PCA）是根据群体的原始数据矩阵计算出单个个体的特征向量，再绘制特征向量的散点图来获得群体分类情况。34个样品基于主成分1和主成分2绘制PCA图（图3）。可见，每个种群都分布得很集中，这与系统树结果一致。其中DXC、CWC、BMC、BBC和WXC2分布相对集中。在PC2维度上，WXC1与其他种群相隔得较远，这与structure分析的结果一致。

2.3 群体遗传多样性分析

对7个种群的遗传多样性信息进行的统计分析表明（表2），34份材料的平均Ho、He和π分别为0.156 9、0.165 4和0.186 5，各种群中均具有特有等位基因，平均值为828.29，其中BSC的特有等位基因最高（1 445），同时其Ho最低（0.079 1）。核苷酸多样性（π）分析表明，π=0.015 02～0.239 9，在采样地东部的Cluster 1种群（BMC、CWC和DXC）具有更高的遗传多样性。FIS =-0.006 1～0.168 3，种群内FIS平均值为0.061 67，其中CWC和WXC2略为负值，说明这两个种群存在杂合子过剩现象。

基于38 667个SNPs位点的34个水角样本种群间成对的FST值计算结果（表3）表明：FST为0.203 5～0.584 6，其中CWC与BMC之间的FST值最小（0.203 5），表明两个种群间的遗传交流在所有种群间最为频繁。其他成对FST均大于0.25表明水角7个种群间的遗传分化程度较高。其中，WXC1种群分化最大，与其他6个种群间的遗传分化系数均值为0.528 1。

2.4 AMOVA分子方差分析和Mantel检测

AMOVA分子方差分析的结果（表4）显示，当把7个水角种群分成上述3个群组时， 9.35%的遗传变异发生在组间，群组间的遗传分化系数为FCT=0.093 53，说明群组间的遗传分化不显著。种群内的遗传变异占总变异的52.65%，种群间的遗传变异率为38%。基于遗传距离和环境距离的Mantel检测，结果表明两者之间存在显著正相关（R=0.434 6，P=0.041 2）（图4：A）；基于遗传距离和地理距离的Mantel检测， 结果证明两者之间不存在显著的联系（P=0.339 3）（图4：B）；基于环境距离与地理距离的Mantel检测结果表明环境距离与地理距离呈显著正相关，意味两者之间存在很强的联系（R=0.643 2，P=0.008 2）（图4：C）。

2.5 群体大小历史分析

为在Stairway Plot中对水角的群体大小随时间变化进行推测，首先筛选到不连锁的SNP数量38 667个。Stairway Plot推测该种群100 kya～1 kya的有效群体大小变化（图5）。由图5可知，在11.7 kya的末次冰期（last glacial period， LGP）以后，种群有收缩趋势。在MID时期，特别是在4 kya～2 kya，水角有效种群大小出现明显的下降。

2.6 不同情景下的潜在分布格局

根据MaxEnt模型AUC值均大于0.952，表明该模型预测物种适宜分布区的结果比较可靠。在环境变量中，温度季节性、最冷月份的最低温度、年平均温度和海拔所占贡献率较大，表明它们是影响水角分布的主要环境因子。

结果表明从MID时期到当代 （图6：A，B和表5），水角的总适生面积大幅度的减少，主要表现在高适生面积减少29%，中适生面积减少34%。未来在SSP1-2.6情景下（图6：C和表5），水角的潜在分布总适生面积较当代增加了4.74%，主要表现在低适生面积较当代增加了33.40%。在SSP5-8.5情景下 （图6：D和表5）， 水角的总适生面积变动不大，但是高适生面积大幅减少， 高适生面积较当代减少了23.34%，中适生面积较现在减少了4.91%，而低适生面积增加了72.94%。由此可见，在未来随着CO2浓度的升高，全球平均温度的升高，海平面的上升，生境破碎化严重，对水角的高适生区有很大的影响，大量的高适生区将会丧失或转化为低适生区。

3讨论与结论

3.1 水角的遗传多样性：生境片段化降低了水角的遗传多样性

自20世纪90年代以来，生境片段化问题在国内逐渐受到关注，一直是保护生物学和生态学领域的研究热点之一。起初集中在热带雨林中开展（朱华等，2001；王喜龙等，2016），亚热带森林次之（李铭红等，2008）。在不同生境类型中，岛屿的研究仅占2%（吴倩倩等，2017）。研究物种的遗传多样性，不但可以反映物种适应环境变化的潜力，而且还可以为物种资源特别是濒危物种现有的生存方式及状态进行有效的评估（Mable， 2019）。研究发现，由于遗传漂变和近交的原因，地理分布广泛的物种遗传多样性高于地理分布狭窄的稀有和濒危物种（Cole， 2003），遗传多样性水平较低是一个物种濒危或分布狭窄的普遍特征（Gitzendanner & Soltis， 2000；景昭阳等，2023）。核苷酸多样性是衡量群体遗传多样性的整体指标（Catchen et al.， 2013b）。本研究利用SNP分子标记对水角7个种群进行群体遗传学分析，结果显示水角具有较低的遗传多样性（π=0.186 5，Ho=0.156 9，He=0.165 4）。在濒危植物荷叶铁线蕨的群体遗传分析中也有类似的发现，其不同居群的平均π、Ho和He分别为0.373、0.106和0.135（孙维悦等，2022）。与木本植物相比，草本植物具有更低的遗传多样性（Chung et al.， 2020）。利用RAD-seq技术研究的极危树种波叶杜鹃的遗传多样性为（π=0.241 0，He=0.226 7）（曹毓蓉等，2022）。与同科的物种相比，水角的平均He为0.165 4，略低于大旗瓣凤仙花（Impatiens macrovexilla）的He（0.018 6）（Zhou et al.， 2020）。同时本研究结果发现，水角的平均Ho小于平均He，尽管结果在统计上不显著，但这也暗示着水角种群中存在杂合子缺失和一定程度的近交，是生境片段化的遗传效应的表现。Dixo等（2009）研究发现，巴西大西洋沿岸森林中蟾蜍（Rhinella ornata）种群遗传多样性与破碎化面积呈正相关，生境片段化对剩余栖息地之间的基因流也产生负面影响。生境片段化导致种群之间的遗传流动受到限制，从而导致种群内部的近亲交配增加，杂合子缺失的发生，进而降低其遗传多样性。

不同种群间的遗传距离有助于对不同种群的遗传多样性进行研究， 也可用来表述群体遗传结构差异。不同种群之间的群体遗传多样性可通过FST进行研究。当FST为0.25以上，表示种群间有很大的遗传分化（Wright， 1978）。在水角7个种群两两之间的21对FST中有20个FST大于0.25，表明7个种群间的遗传分化水平较高。AMOVA分析表明，水角38%的遗传变异发生在组内群体间，而群体内的遗传变异更高，为52.65%。当前并未见有对水角遗传多样性的研究，凤仙花科仅仅包括水角屬和凤仙花属，这些植物在分类学上密切相关。因此，对凤仙花科的研究结果可以为水角的遗传多样性研究提供一些初步的参考。钟云芳等（2014）利用ISSR对凤仙花科的研究中发现，海南凤仙花（Impatiens hainanensis）自然种群的主要变异来自种群内（92%），种群间变异较少（8%），水角也有与之一致的结果，即种群内的遗传变异较大。同时在对大旗瓣凤仙花的研究中也发现，无论是利用ISSR分析（李祥军，2013），还是使用基于“跳跃基因”或基于逆转录转座子的引物间结合位点（inter-primer binding site， iPBS）标记系统来评估（Zhou et al.， 2020），其种群内的遗传多样性大于种群间的，即主要的遗传多样性存在于种群内，表明该种在收集种质的每个地点都有广泛的基因型。在聚类分析、遗传结构分析和PCA分析中，本研究收集到的海南水角群体可分为3个具有不同遗传组分的组。尽管存在这些不同的遗传组分，但其组间的遗传分化较低（FCT=0.093 53）。考虑到水角的生境特征以及人类建筑、农田等人为屏障的存在，我们推测亚居群的形成可能是生境隔离所致。

对水角的环境距离、遗传距离和地理距离的Mantel相关性检验结果表明：水角环境距离与地理距离具有显著的正相关（P=0.008 2），同时环境距离和遗传距离也存在显著的正相关（P=0.041 2），意味着水角种群之间的遗传分化与它们之间的环境差异有关，并且这种环境差异与地理距离的变化密切相关。但是其地理距离与遗传距离没有显著相关性（P=0.339 3），即水角种群的遗传距离没有随着隔离距离的增加而增加。这与海南凤仙花自然种群的遗传距离和地理距离呈显著的高度相关性（r=0.952，P<0.01）有差异（钟云芳等，2014）。这可能是水角不同于广泛的水生植物，其具有肉质假浆果，裸露于水面或沉入水中，可供鸟类或鱼类等动物取食，因此其地理距离不能反映其种群的遗传距离。也可能与水角的狭窄分布，不同种群间其地理距离过近有关。总体而言，水角种群遗传分化水平高，遗传距离与环境距离相关但与地理距离不相关，这说明水角种群间的遗传分化主要受到生境片段化所引起的环境距离的影响，而不是地理距离的影响。

3.2 水角的群体历史：万年前琼北火山群爆发后水角种群大小急剧衰退

物种的种群历史动态是其所经历的历史事件和遗传特性共同作用的结果（Hewitt， 2000），能预测物种当前和未来的生存力（Hare et al.， 2011）。本研究通过使用大量的SNP标记对水角进行群体大小历史分析，发现水角在100 kya到末次冰期之前，有效种群大小都相对稳定，我们推测这与全新世早期，全球性气候转温，海南岛植物区系较为兴盛发达有关（颜家安，2006）。水角的有效种群大小从末次冰期（LGP：11.2 kya）后开始持续下降，直至现在。琼北火山群的喷发活动可能发生在距今约1万年（樊祺诚等，2004），这与水角有效种群大小开始下降时间吻合，推测琼北火山群的喷发活动可能引起土地破坏、气候变化或其他环境因素的改变，导致水角生境的片段化，限制了水角的基因交流。在MID时期，水角有效种群大小在明显下降。MID是一个全球范围内人类活动扩张的重要时期。在这个时期，人类社会经历了从狩猎采集生活方式向农业和定居生活的转变，这对环境演化也产生了重要影响。在新石器中晚期，有1万余人觅食于海南岛，与植物争地，植物生境也逐渐发生较大的变化（司徒尚纪，1987）。蒋有绪等（2002）对海南岛北部火山口沉积孢粉的研究，发现海南岛的农业活动早在3 000 aBP就开始对地低植物具有较明显的影响。由此推测，水角的有效种群大小在历史时期首先受到琼北火山群爆发的影响，进而又受到人类活动的影响，两种因素叠加导致生境的持续变化。这种有效种群大小的减少可能导致了其遗传多样性的丧失和种群的遗传分化，逐渐形成如今的分布格局。

3.3 水角的潜在分布格局：高CO2排放情境下水角的高适生区转变为低适生区

在环境因子贡献率的分析中，本研究分析所得，温度季节性、最冷月份的最低温度和年平均温度的总贡献率占比达67.6%，这与水角喜温怕寒，温度低于15 ℃即停止生长的生活习性相符（王景飞等，2017）。而海拔占了第四高的贡献率7.4%，表明它是影响水角分布的主要环境因子之一，也佐证了在海南凤仙花的研究中低海拔的遗传多样性远远高于高海拔梯度的种群这一结果，说明海拔是影响群体基因流的重要因素（钟云芳等，2014）。

对不同气候情景下东南亚地区的水角的潜在分布适生区进行模拟分析，结果表明从MID时期到当代，水角的总适生面积大幅度的减少，其中位于海南岛的适生区由高适生区和中适生区的分布格局转变为当代的以低适生区为主的分布格局。这与种群历史动态分析结果一致，表明从MID时期开始，水角的生存受到威胁直至现在。与当代气候相比，在未来气候变化下水角的潜在分布区总面积变动不大，但低适生面积较当代增加了33.40%。特别是在SSP5-8.5的气候环境情景下，高适生面积较现在减少了23.34%，取而代之的是低适生面积增加了72.94%。其中，位于马来群岛的适生区几乎完全消失。根据政府间气候变化专门委员会（Intergovernmental Panel on Climate Change， IPCC）发表的《第六次评估报告》，在SSP5-8.5的气候环境下，CO2排放量到2050年将增加一倍，到2100年全球平均气温将升高4.4 ℃。我们推测这可能与气候变暖条件下亚热带北界向北推移有很大的关联，未来CO2浓度升高将引起全球变暖，动植物的分布逐渐向高纬度和高海拔地区移动（Tingley， 2014），从而导致水角在马来群岛的适生区近乎消失。这些分析结果表明，未来的气候变化将进一步影响水角的适生区，特别是高适生区将面临丧失和转变的风险。这说明水角种群面临着适生环境变化的挑战，其保护策略也应随之调整。

人类开荒、伐木、放牧等活动以及交通和水库建设等是全球自然生境面临着生境丧失、片段化威胁和生物多样性降低的主要原因（Laurance et al.， 2014; Haddad et al.， 2015）。城市化也加剧栖息地的破碎化，特别是对于城市中残余的小种群本土植物更是如此。

对于水角而言，較低的遗传多样性水平，可能削弱了其在迁徙过程中的适应潜力，导致其有效种群规模降低。种群内的遗传分化系数较高，说明其自然种群之间的基因流动较少。环境距离与遗传距离、地理距离之间均呈显著正相关，表明环境因素在水角种群遗传分化中起到重要的作用，而地理距离则作为间接因素通过影响环境差异来影响遗传分化的发生。因此，限制水角种群发展的重要原因来自其自身较低的遗传多样性和生境因素，具体表现为湿地生境的片段化严重，再加上人为活动干扰、城市化等不利的环境条件使得其生境进一步被破坏，种群规模进一步减小，逐步形成如今濒危的状态。针对水角濒临灭绝这一现象，一方面要着重保护湿地免受人为因素的破坏，其次进行就地保护，更有效地提高其群体的遗传特性；另一方面采用人工授粉等方法提高其基因流，以促进其种群的发展。

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