贵州野生猕猴桃表型遗传多样性分析

韩振诚,李苇洁,王加国,任春光,李良良,苏文文

(贵州省山地资源研究所,贵阳 550001)

猕猴桃为猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)植物,全世界共有54个种,约75个变种、变型[1]。近年来,中国在猕猴桃种质资源的调查、收集、保存、遗传多样性检测、 起源与演化以及经济性状评价和种质创新方面研究较多,培育了东红、脐红等优良品种[2-3],并广泛应用于生产栽培中。遗传多样性越丰富,物种对环境变化的适应能力越强[4],用于选育新品种的潜力就越大,贵州是猕猴桃属植物的集中分布区之一[5],但随着贵州猕猴桃产业的发展,加强猕猴桃种质资源的收集、保存与利用,明确野生猕猴桃资源的植物学分类地位,准确评价贵州猕猴桃资源的遗传多样性,对于猕猴桃新品种选育具有重要意义。

表型多样性是植物遗传多样性的重要组成部分,亦是优异单株鉴选的重要依据[6-7]。表型多样性研究主要通过科学有效的采样,合理的数学统计,采用形态特征、生理生化等性状揭示群体的遗传规律和多样性[8-9]。表型多样性广泛应用于猕猴桃遗传多样性的研究中,姜存良利用15个表型性状将云南省24个野生猕猴桃种分为4 组,属间各种存在着丰富的变异,性状间变异系数相差较大,能了解现阶段云南省部分地区猕猴桃野生资源的分布状况[10];李红莉等通过对98份野生软枣猕猴桃资源的表型遗传多样性分析得出,黑龙江软枣猕猴桃枝条、叶片和果实表型性状变异类型丰富、变异程度高且幅度大,遗传多样性丰富,育种选择潜力大[11];秦红艳等对70份软枣猕猴桃资源的果实表型性状、果实品质性状等指标进行相关分析表明,果实质量、果径以及果实营养品质等性状可作为区分和评价软枣猕猴桃资源的主要性状指标[12];而汤佳乐等的研究表明毛花猕猴桃在野生状态下存在丰富的表型性状多样性,其果实形状、果实纵横径、果心、果实横截面形状、果基、果顶形状以及被毛的颜色等性状均表现出较高的多样性和差异性,且野生资源中存在优良果实表型的单株[13]。

贵州拥有丰富的猕猴桃资源,但资源遗传信息分析评价欠缺,遗传多样性状况尚不明确,资源保护力度不够。基于此,本研究采用文献查阅、实地踏查的方法系统调查和研究贵州146份猕猴桃种质资源(140份野生资源、6份品种资源)的57个表型性状,运用主成分分析和聚类分析法进行遗传多样性综合评价,以期为优良单株鉴选及新品种选育提供理论依据和种质基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

在野生猕猴桃资源调查前,根据查阅文献[14-17]和咨询专家,进行采集地的选择。2016年8月-2021年9月,课题组实地调查贵州四大山脉8个地区(州、市)30个县(区、市),收集到146份猕猴桃资源(140份野生资源、6份品种资源),参照《中国植物志·第四十九卷》和《贵州植物志·第三卷》[18-19]所描述的文字和图片资料,对所采资源进行分类鉴定(表1)。

表1 贵州野生猕猴桃资源采集地基本信息

1.2 方 法

1.2.1 贵州野生猕猴桃种质资源采集

根据贵州的地形地貌和四大山脉自然生态区域将采集地分为北部大娄山(遵义市)、南部苗岭(贵阳市、黔东南州、黔南州、黔西南州)、西部乌蒙山(毕节市、六盘水市)和东部武陵山(铜仁市)。

采摘猕猴桃果实、叶片、枝条,根据所保存资源的顺序编号对其进行命名,记录所采集样品的地址、海拔等信息(表1),参照《猕猴桃种质资源描述规范和数据标准》[20]的方法,在现场进行记录。将成熟果实置于冰盒中带回实验室,待果实后熟后(手捏稍软),切成小块液氮速冻,放置于-80 ℃冰箱保存备用,并标记名称和日期。

1.2.2 贵州野生猕猴桃种质资源质量性状赋值

质量性状包括果实、枝条、叶片、花朵的48个描述性表型性状,参照《猕猴桃种质资源描述规范和数据标准》的方法进行描述和赋值,并进行标准化数值转化。

1.2.3 贵州野生猕猴桃种质资源数量性状测定

参照《猕猴桃种质资源描述规范和数据标准》的记录,测定资源的9个数量性状,测量146份资源叶纵径、横径、叶柄长,记录数据并统计;利用电子天平称量果实单果重,用游标卡尺测量果实纵径、横径,计算果形指数,每个指标重复6次;可溶性总糖含量采用蒽酮比色法测定;可滴定酸含量采用酸碱滴定法测定;Vc含量采用2,6-二氯靛酚染料滴定法测定[21]。每个指标重复3次。

1.2.4 数据处理

整理猕猴桃种质资源质量性状的转化标准数据和数量性状的测定数据,利用Excel统计各性状的标准差、平均值、变异系数、变幅等;利用SPSS 23.0进行主成分分析、R型聚类分析和Q型系统聚类分析,得出各主成分因子负荷量、特征向量、贡献率、累计贡献率[22-24],欧氏遗传距离[25-27]等。

利用Shannon-Weinner方法对4个生态区域的表型性状遗传多样性指数进行计算,将每个地区内所有种质的质量性状的类型分布频率进行统计,计算多样性指数平均值表示此区域内的遗传多样性程度[28-29],计算公式为:

式中:S为表型分类数;Pi为该性状第i类的表现频率[7]。

2 结果与分析

2.1 贵州野生猕猴桃资源分布及各区域遗传多样性指数

由图1可知,本次调查与研究贵州野生猕猴桃资源共计12个种(变种)146份资源,其中引进并嫁接保存在资源圃的国内外资源6份,贵州本土收集的野生资源140份,分布于贵州8个地州市,南部苗岭8个种65份资源,东部武陵山5个种26份资源,西部乌蒙山4个种26份资源,北部大娄山4个种23份资源,使用当地野生美味猕猴桃繁育的苗木作为砧木,将资源进行嫁接保存。遗传多样性指数是反映物种丰富度的重要指标[28],其数值的高低可以反映地区间物种的栽培演化趋势[30-31]。将146份资源按照采集地点划分为4个区域,以不同地区间样品的差异进行遗传多样性分析。

图1 贵州野生猕猴桃种质资源分布

贵州各区域猕猴桃种质资源的表型遗传多样性有一定差异,146份贵州猕猴桃种质资源表型遗传多样性指数为1.28;其中,南部苗岭(1.26)、西部乌蒙山(1.22)位于贵州南部和西北部,在云贵高原的过渡地区,均高于北部大娄山(1.21)和东部武陵山(1.17),以各区域遗传多样性指数可初步判断贵州野生猕猴桃资源间南部苗岭、西部乌蒙山、北部大娄山与东部武陵山在演化进程上从遗传多样性指数高的地区向低的地区进行演化(图2)。

图2 贵州野生猕猴桃资源区域间遗传多样性指数

2.2 贵州野生猕猴桃资源质量和数量性状

146份猕猴桃资源的48个质量性状存在丰富的多样性(表2),果实形状主要为长圆形,约20.5%;叶片形状中阔卵形叶片占比例最大,约40.41%;果肉颜色黄绿占比例最大,约45.21%;果心颜色有白色、绿白色、浅黄、橙色、紫红,其中白色占85.62%。

表2 贵州野生猕猴桃质量性状分布频率

以9个数量性状对146份猕猴桃资源的数据统计结果(表3),9项指标变异系数为14.98%～74.33%,呈现出丰富多样性。猕猴桃资源Vc变异范围为3.87～277.00 mg/(100 g),均值为67.11 mg/(100 g),变异度为74.33%;糖酸比的变异范围为1.18～26.57,均值为7.80,变异度57.60%;单果重变异范围为0.75～135.00 g,均值为33.77 g,变异度为70.21%,单果重最小的为革叶猕猴桃,仅为0.75 g;果形指数的变异范围为0.82～3.15,均值为1.31,变异度为25.66%;可溶性总糖的变异范围为1.30%～15.8%,均值为6.77%,变异度为46.87%。

表3 贵州野生猕猴桃资源的数量性状

2.3 贵州野生猕猴桃资源主成分分析

由表4看出,主成分以累计贡献率大于75%的依据来选择,前14个主成分累计贡献率达75.076%,基本可以反映原始因子所代表的大部分信息。

表4 贵州野生猕猴桃各表型性状因子负荷量

表4中下划线表示特征向量绝对值最大的3个值,以反映其对应性状的贡献率,第一主成分特征值为19.629,与新梢被毛、果实被毛、果实被毛类型呈正相关;第二主成分与单果重呈正相关,与果实形状和花冠类型呈负相关;第三主成分与髓部形状呈正相关,果点大小、果点状况呈负相关;第四主成分与果心大小和枝条髓部呈正相关,与糖酸比呈负相关;第五主成分与树势、叶横径呈正相关,与花序类型呈负相关;第六主成分与枝条色泽、可溶性总糖含量呈正相关,与花药颜色呈负相关。

51.911%的累计贡献率来自前6个主成分,所以评价贵州猕猴桃种质资源的重要指标可认为是新梢被毛、果实被毛、果实被毛类型、单果重、果实形状、花冠类型、髓部形状、果点大小、果点状况、果心大小、枝条髓部、糖酸比、树势、叶横径、花序类型、枝条色泽、可溶性总糖含量、花药颜色。这样可以简化描述指标,提高贵州野生猕猴桃种质资源评价和选育鉴定工作的效率。

PC1(第一主成分)和PC2(第二主成分)的贡献率分别是19.629%和9.166%,以PC1 和PC2 分别为纵横坐标,绘制不同性状主成分值散点图(图3)。图3 揭示了不同性状之间在PC1和PC2坐标轴上的关系,使主成分分析结果更加直观的通过位置分布看出性状之间是否相关。

新梢被毛(HAB)、果实被毛(FH)、果实被毛类型(TFH)、果实被毛色泽(HCF)等性状在PC1 主成分值上基本一致,与PC1呈正相关,比重较高;花冠类型(BT)和果实形状(FS)在PC2 主成分值上比较接近,且与PC2呈负相关,单果重(FW)在PC2 主成分上值较大,在主成分分析中,性状间位置相近的性状说明存在相关性。

2.4 贵州野生猕猴桃各性状R型聚类分析

如图4所示,贵州野生猕猴桃在欧氏距离D=19.0 处可将贵州猕猴桃的57个性状分为3类。第Ⅰ类包括花瓣内侧主色、花丝颜色等性状,主要描述花朵和果实内在的相关性状;第Ⅱ类包括被毛密度和果实被毛密度等指标,主要描述枝条、果实、叶片的被毛情况;第Ⅲ类有果点大小、果点状况等指标,主要描述皮孔、果点、叶片的相关性状。

图4 贵州野生猕猴桃57个性状R型聚类分析

欧氏距离最近的性状是花瓣内侧主色和花丝颜色,果实被毛和果实被毛色泽,新梢被毛和被毛颜色,被毛类型(新梢)和果实被毛类型,说明这几个性状存在相似性,在聚类分析中差异不明显,在应用时保留其中一个性状可起到简化作用,不影响聚类效果。

2.5 贵州野生猕猴桃资源表型性状Q型聚类分析

Q型聚类分析的功能是建立一种分类方法,综合利用多个变量的信息对样本按照它们在性质上的亲疏程度进行分类,使得分类结果直观、清楚地表现其分类结果并且比传统分类方法更细致、全面、合理。

通过聚类分析,同一类群内的样品资源在形态特征上较为相似,可反映出相近的遗传背景[30,32]。采用组间联结、平方欧氏距离的方法对146份猕猴桃种质资源的57个表型性状指标进行分析,图中数字按照资源采集序号进行标注。

在聚类分析中(图5),146份资源在欧氏距离D=19.25处,将146份资源分为6个类群。第Ⅰ类群有“贵山F203”、“贵山F204”等117份资源,特点是新梢被毛,果实被毛,皮孔长梭形、灰白,果皮颜色为褐色,包括蒙自猕猴桃、糙毛猕猴桃、中华猕猴桃和美味猕猴桃;第Ⅱ类群包括“贵山F126”、“华特”等6份资源,为毛花猕猴桃,其特点是新梢和果实均密被白色绒毛;第Ⅲ类群包括“贵山F134”“贵山F179”“贵山F210”3份资源,包括葛枣猕猴桃和大籽猕猴桃,其特点是果实光净无毛,无果点,枝条髓心单孔状,花序类型为单花,新梢无毛,果肉颜色在成熟时呈橙黄色等;第Ⅳ类群只有“贵山F096”“贵山F128”2份资源,为革叶猕猴桃,花瓣内侧主色为粉红色; 第Ⅴ类群包括“贵山F008”和“贵山F053”等4份资源,包括阔叶猕猴桃,其特点是花序为多歧聚伞花序,果实无毛或脱落,果点较大,果顶形状为浅尖凸;第Ⅵ类群包括“龙城2号”“魁绿”等14份资源,包括软枣猕猴桃、硬齿猕猴桃和京梨猕猴桃,特点是枝条皮孔明显、叶片呈披针形,叶尖急尖,果实无毛。

图5 贵州野生猕猴桃资源Q型因子聚类分析

3 讨 论

3.1 贵州野生猕猴桃种质资源分布现状

贵州地处中国西南,喀斯特地貌突出,区域生物多样性丰富、生态系统复杂。贵州野生猕猴桃分布最广、最多的地区是南部苗岭地区,表型遗传多样性指数1.26,包含8个种,65份资源,其中分布有种群数量较小的蒙自猕猴桃;该地区资源性状类型呈现多样性,如果实形状有短圆、梯形等10个类型,叶片形状包括披针形、卵圆形、心脏形等7个类型,果实被毛类型有6个,种群多样和性状类型多样同时说明该地区的猕猴桃多样性最丰富。在地理区划上可以看出,苗岭在云贵高原的中间地带,海拔落差(地形起伏)较大,植物类群多样性较高,有多个自然保护地,比如雷公山国家级自然保护区、茂兰国家级自然保护区等,植被茂密,适宜猕猴桃的生长繁衍,很多猕猴桃资源的分布呈现出点状分布的特征,比较适合探讨其生物地理起源与扩散途径。其次是西部乌蒙山,遗传多样性指数为1.22,有4个种26份资源,地处贵州西北部高寒冷凉地区,果实形状有10个类型,叶片形状7个类型,类型多样可能是该地区多样性指数较为丰富的原因;北部大娄山遗传多样性指数为1.21,包含4个种,23份资源,种群和资源数量较少,从而导致该地区的多样性稍低;东部武陵山遗传多样性指数为1.17,野生猕猴桃的性状类型较少,多样性最低。

现有研究显示,贵州有27个种[5],本文对收集到的12个种(变种)进行了区域分布探讨。其中分布最多的是美味猕猴桃和中华猕猴桃,在全省各地均有分布,野生果实产量可观,具有一定经济价值,优异的资源较多,有大果型、硬毛红肉型、高Vc型等;硬齿猕猴桃和京梨猕猴桃分布也较广,尤其是以武陵山脉梵净山区域为主,田间沟坎随处可见;毛花猕猴桃在多个地区均有分布,苗岭山脉最多,单果重较小,成熟期在10月底至11月份,口感较酸,Vc含量均较高;葛枣猕猴桃在全省多地均有分布,因其成熟时果实橙色,在野外也极容易辨别;革叶猕猴桃仅在武陵山脉发现,其花呈粉红色,可作为观赏性资源进行发掘利用;阔叶猕猴桃花序为总状花序,果实呈串状,在贵州黔东南州分布较多;糙毛猕猴桃在苗岭地区分布较多,当地俗称“马奶子”,果实较小且涩,口感较差;大籽猕猴桃在贵州多处均有发现,多数分布在苗岭山脉,被当地农户作为抗涝性砧木;在荔波发现蒙自猕猴桃,果实小,果点明显、大、零星有黄褐色糙毛。

贵州猕猴桃资源种类丰富,有巨大的遗传价值。但近年的调查数据显示,整个猕猴桃属植物野生种群的现状不容乐观,一方面是部分野生猕猴桃种质资源的经济性状不明显,得不到当地群众的重视,缺乏有效保护,从而造成了资源流失;另一方面是野生猕猴桃分布不均、雌雄比例失调、人类活动的扩张、自然环境日益恶劣及野外采集的破坏性都会对野生猕猴桃资源带来不利影响。在后续资源收集过程中,应加强资源保护的宣传力度,健全种质资源的保存规范,在猕猴桃集中分布的核心区建立自然保护区,设立隔离栅栏和警告标志,禁止无关人员进入,还要加强贵州野生猕猴桃外植体活体保存的相关技术研发,建立猕猴桃种质资源圃等方式进行保护。

3.2 贵州野生猕猴桃优异资源、优良性状分布情况

植物稳定的优良性状是植物基因型和环境共同作用的结果[33],稳定且优良的性状可作为实生选种或杂交亲本的重要材料,贵州存在大量的优异资源和优良性状,为猕猴桃资源鉴选工作提供重要的种质基础。在此次调查中,不仅探讨了贵州猕猴桃的遗传多样性水平和各种(变种)的分布,还发现资源的优良性状分布具有区域性,比如,贵州野生猕猴桃中的大果资源,贵山F115,最大单果重达到137 g,平均单果重77.16 g,贵山F005的平均单果重114.17 g,此类“大果型”资源多存在于东部武陵山,少数在南部苗岭,推测该地区资源中控制猕猴桃果实单果重的功能基因表达突出,可在后续育种中深入挖掘利用;在贵州西部乌蒙山发现野生美味猕猴桃果肉为红色或紫红色性状的资源,颜色较“红阳”猕猴桃更加鲜艳,可作为“红肉猕猴桃”的预备育种资源进行利用;野生猕猴桃中Vc含量高的资源多在南部苗岭分布,其中贵山F121、贵山F144和贵山F179的Vc含量分别达到203.85,187.27,200.69 mg/(100 g),此外,该地区的毛花猕猴桃数量较多,其中是否存在自然杂交或遗传渐渗有待进一步探讨;猕猴桃抗逆性状在猕猴桃生产中也极为重要,比如部分野生资源具有耐涝性,较强的树势等,耐涝性相对较强的资源有大籽猕猴桃和葛枣猕猴桃,在南部苗岭和西部乌蒙山均有发现;树体生长势极强的资源在全省都有分布,都为美味猕猴桃,这些资源的实生苗可作为抗逆型砧木进行培育,也可作为杂交育种亲本。

3.3 贵州野生猕猴桃种质资源表型遗传多样性

表型性状变异是生物遗传多样性在形态水平上的表现[34],表型聚类分析中,贵州猕猴桃种质资源的欧氏距离为1.00～25.00之间,表明贵州猕猴桃资源具有丰富的多样性。初步聚类结果显示被分为6个类群,可以得到每个类群在育种中的利用价值。第I类群主要包含生长势强、大果型资源,可作为育种的主要材料,包括糙毛猕猴桃、蒙自猕猴与美味猕猴桃桃和中华猕猴桃,中华猕猴桃与美味猕猴桃能够聚类到一起,说明2个种(变种)的遗传距离较近,与刘磊和黄宏文的研究一致,均表示这2个种在贵州分布最多、最广,且种间具有同域分布及天然杂交现象[5,17,35],糙毛猕猴桃和蒙自猕猴桃遗传距离较近,且与中华猕猴桃近缘,在表型聚类中,新梢均为被毛,密度稀疏,髓部均为片层状等共同特点,其真实的遗传关系在后续的分子标记分析中再次进行研究讨论;第Ⅱ类群中只有毛花猕猴桃,特点是果实和新梢均被白色绒毛,其中,Li等的研究显示,中华猕猴桃与毛花猕猴桃遗传距离较近,存在近缘关系[36],本文中,毛花猕猴桃与中华猕猴桃、美味猕猴桃的距离一致,均存在近缘关系,与Li等的研究稍有不同;第Ⅲ类群中葛枣猕猴桃与大籽猕猴桃聚到一类,这2个种的特点是髓实心,白色,果面光滑无毛,无果点,成熟时果肉橙色;第Ⅵ类群包括硬齿猕猴桃、京梨猕猴桃和软枣猕猴桃,硬齿猕猴桃与京梨猕猴桃亲缘关系较近,此研究与黄宏文、姜存良的研究相符[5,10],在这些资源中,软枣猕猴桃果实不需后熟直接食用,且果实光洁无毛,可作为特色资源进行小面积种植。聚类分析区分了各类群间资源的亲缘关系,明确种间性状特征。

3.4 聚类分析在种质资源应用分类中的意义

本文调查了146份资源的57个性状指标,数据量、工作量较大,在数据处理中,使用R型聚类和主成分分析进行指标的简化。R型聚类分析是对研究对象的表型指标进行聚类,讨论各性状间的关系,从而得出差异,分类后可评价性状间的关联性,验证主成分分析结果,简化种质资源的筛选、评价指标[26]。主成分分析主要通过原变量间具有较强相关性的特点,对原变量进行降维,采用综合因子或少量的因素来描述多种指标或因素之间的关系,使这些综合因子尽可能保留原变量的信息量,而且彼此之间互不相关,从而达到简化的目的[24,27-28,37]。从R型聚类树状图可以看出,在欧氏距离19.0处,将57个猕猴桃资源性状分为3类,每一类群下各性状关联性较强,逻辑相关的指标有花瓣内侧主色和花丝颜色,果实被毛和果实被毛色泽,新梢被毛和被毛颜色,被毛类型和果实被毛类型,这几个性状之间可进行简化,对数据分析能起到精简的作用,这与主成分分析的结果是相吻合的,也说明了用这2种方法对表型指标进行简化、筛选是可行的,有效的。

猕猴桃的表型性状是基因遗传与环境协同作用的综合体现,此研究中,贵州省野生猕猴桃资源分布区域的生态条件存在差异,对聚类结果也可能会产生影响。今后结合分子标记研究猕猴桃的遗传多样性并与此文结论相互印证将会更加准确地评价贵州遗传多样性水平,也将是后续工作的重点。

4 结 论

本文有效揭示了贵州省野生猕猴桃种质资源丰富的多样性和亲缘关系,明确猕猴桃各种群间性状区分特征和部分优良资源性状的地理分布,对贵州猕猴桃种质资源的种质鉴定、保护利用和品种选育有重要意义。