欧李种质资源果实酚类物质分析及种质评价

邵郅胜,张 薇,孙 聪,郭金丽

(内蒙古农业大学 园艺与植物保护学院,呼和浩特 010018)

欧李(Cerasushumilis)属蔷薇科樱桃属极矮生灌木,为我国特有野生果树资源[1],主要分布于内蒙古、山西、辽宁、河北等北方地区。欧李果实香气浓郁、风味独特,同时富含酚类物质、氨基酸、维生素和Ca、Fe、Se等,备受人们关注[2]。欧李资源丰富,具有抗旱、抗寒、耐瘠薄,综合适应性强的特点,适用于寒旱地区经济林建设及生态修复治理[3-4]。欧李果实鲜食加工俱佳,可深加工成果酒、果汁、果酱、红色素等系列产品[5]。此外,欧李仁可入药[6],叶可制茶[7]。欧李集果、种子、叶等综合开发利用于一身,具有极高的营养价值、药用价值和生态价值,开发前景广阔[8]。酚类物质是一类重要的果蔬次生代谢物质,广泛存在于植物组织中,可有效抑制细菌、真菌等病原体的侵染,在抵抗病原菌方面发挥重要作用[9-10]。酚类物质对果实色泽、口感风味、产品褐变等方面[11-12]具有重要影响;在人类健康方面具有抗氧化、清除自由基、预防心血管疾病、延缓机体衰老等多种生理活性和功能[13-18]。

本课题组[19]初步研究表明,欧李果实中酚类物质含量丰富,酚类物质及其抗氧化特性是欧李果实品质的重要特征之一,研究了解欧李果实酚类物质及抗氧化的特性特征,可为欧李果实品质提升、品种选育等进一步研究应用打下基础。内蒙古高原作为中国欧李集中分布区域之一,具有丰富多样的欧李种质资源。本课题组多年来进行内蒙古地区欧李种质资源收集与研究,从丰富多样的内蒙古欧李种质资源中初步筛选出部分优系资源开展进一步深入研究。在前期工作的基础上,本试验以内蒙古36种欧李优系资源为材料,对果实酚类物质、抗氧化活性、酸度、果肉色4个品质性状的9个指标,利用主成分分析、相关性分析、综合聚类分析等相结合的方法,进行种质评价,探讨欧李果实品质性状之间的联系,同时为内蒙古欧李优异资源筛选及进一步研究和应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

36种欧李优系资源来源于内蒙古农业大学欧李科研基地(40°56′19.48″N,111°57′34.95″E)资源圃,通过实生选种方式于2019年于资源圃内选出优良单株,之后通过绿枝扦插无性扩繁形成36份内蒙古欧李优系资源(以MY1-52表示)。每份资源各选取30株进行标记, 10株为 1 次重复,重复 3 次。2021年7月下旬至9月下旬于36种欧李优系资源果实完熟期分别于结果枝的上、中、下部选择果个均匀一致、无病虫害、无机械伤的果实组成样本,洗净晾干后液氮速冻,于-80 ℃冰箱中保存待测。

1.2 提取液制备

取适量欧李果实去核后切碎,称取3.0 g放入研钵,以0.1%盐酸的40%乙醇水溶液做提取液,加50 mL提取液磨碎,超声波清洗仪25 ℃提取1 h,反复提取 3 次,过滤定容至50 mL量瓶,提取液5 000 r/min离心10 min,上清液即为果实提取液,-20 ℃储存待测。3次重复。

1.3 测定方法

1.3.1 果肉色

取欧李果实纵切,目测将果肉颜色归为三大类,浅红、桔黄、红,并赋值(浅红=1,桔黄=2,红=3)。

1.3.2 酚类物质

总酚、总黄酮、原花青素含量参照邵郅胜[20]试验方法进行测定。

1.3.3 抗氧化活性

抗氧化活性4个指标均参照邵郅胜[20]的试验方法,略有改动。

总抗氧化:取1 mL提取液、6 mL 铁离子还原能力(FRAP)工作液、0.6 mL蒸馏水,混合摇匀后于37 ℃水浴20 min。在593 nm 处,用无水乙醇调零,测吸光度。标准曲线以FeSO4溶液制作,用无水乙醇配制FeSO4溶液(浓度梯度200～6 000 μg/ mL),测定标准系列溶液的吸光值,做标准曲线,以无水乙醇代替样品做空白,根据吸光值,求得相应 Fe2+当量定义FRAP值[CVN/1000M,C为样品减去空白吸光度代入Fe2+当量(μmol/L),V为待测液总体积(L),N为样品稀释倍数,M为样品质量(g)]。

总还原力:依次加入2.5 ml pH 7.0磷酸盐缓冲液、100 μL果实提取液、2.5 mL 30.37 mmol/L铁氰化钾,混匀,50 ℃恒温水浴20 min,加入2.5 mL 0.6 mol/L三氯醋酸溶液终止反应。反应体系中取2.5 mL上清液,加2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 3.70 mmol/L FeCl3溶液,反应10 min后于700 nm处测定吸光值;以蒸馏水代替提取液作空白。

·OH清除率:依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4、1 mL 9 mmol/L水杨酸乙醇溶液、400 μL果实提取液,混匀,加入2 mL 8 mmol/L H2O2,4.6 mL蒸馏水,混匀, 37 ℃水浴60 min后取出冷却,于510 nm处测定吸光值;以蒸馏水代替提取液做空白,蒸馏水代替H2O2作为对照。按·OH清除率=[A空白-(A样品-A对照)]/A空白×100%计算。

DPPH·清除率:依次加入2 mL果实提取液、2 mL 0.1 mg/mL DPPH甲醇溶液,混匀,避光反应60 min,于517 nm处测吸光值;以甲醇代替提取液作对照。按DPPH·清除率=(A对照-A样品)/A对照)×100%计算。

1.3.4 可滴定酸

可滴定酸含量采用滴定法测定。

1.4 数据分析

采用Excel 2010统计软件进行数据分析处理,利用SPSS 26.0软件进行相关性分析、主成分分析及系统聚类。

2 结果与分析

2.1 欧李优系资源果实品质性状的变异分析

欧李果实酚类物质、抗氧化活性、酸度及果肉色的差异和多样性分析见表1。果实总酚含量变幅为555.33～1 090.89 mg/(100 g),最大值为最小值的1.96倍,均值为774.35 mg/(100 g),变异系数为16.80%;总黄酮含量变幅为191.56～679.33 mg/(100 g),最大值为最小值的3.55倍,变异系数为31.03%;原花青素含量变幅为222.73～483.94 mg/(100 g),最大值为最小值的2.17倍,变异系数为19.25%。果实总抗氧化活性变幅为9.96～22.09 μmol/g,最大值为最小值的2.22倍,均值为14.70 μmol/g,变异系数为22.12%;总还原力在18.27%～37.70%范围内变化,最大值为最小值的2.06倍,变异系数为17.33%;·OH清除率变幅为38.52%～50.43%,均值为45.31%,变异系数为6.66%;DPPH·清除率在28.49%～63.53%范围内变化,最大值为最小值的2.23倍,变异系数为18.96%。果实可滴定酸含量变幅为1.31%～1.79%,变异系数小,仅为5.91%;而果肉色变异系数则高达30.29%。不同欧李资源类型之间果实的酚类物质含量、抗氧化活性、酸度及果肉色均有不同程度的差异。3种酚类物质中,总黄酮含量的变异程度最高,原花青素含量次之,总酚含量最低;4种抗氧化活性中,变异程度由高到低的顺序依次为总抗氧化活性、DPPH·清除率、总还原力及·OH清除率。可滴定酸含量变异系数最小(5.91%)。果肉色划分为红、桔黄、浅红三大类,变异系数高达30.29%。由上可见,36份欧李优系资源多个品质性状指标均具有丰富的遗传多样性,不同优系资源间性状差异较大,适合进行优异种质分析与评价。

表1 欧李优系资源果实品质性状分析

2.2 欧李优系资源品质性状间的相关性分析

36份欧李优系资源果实酚类物质含量、抗氧化活性、酸度及果肉色4个品质性状的9项指标相关性分析表明:果实总酚、总黄酮、原花青素三者间均表现为极显著正相关,其中总酚与总黄酮相关程度(0.865)最高。果实4项抗氧化指标中,总还原力、·OH清除率和DPPH·清除率三者间均表现为极显著正相关,其中还原力与·OH清除率相关程度(0.539)最高;而总抗氧化活性与其他三项抗氧化指标的相关性均不显著。果实总酚和总黄酮含量均与总还原力、·OH清除率和DPPH·清除率存在显著正相关,相关程度表现为DPPH·清除率>总还原力>·OH清除率;原花青素含量与总还原力、·OH清除率和DPPH·清除率均表现为极显著正相关,与总抗氧化表现显著正相关,相关程度表现为总还原力>·OH清除率>DPPH·清除率>总抗氧化。果实可滴定酸含量仅与总黄酮含量呈显著负相关,与其他指标相关性不显著。果肉颜色与总酚含量表现极显著正相关,与总黄酮、原花青素及DPPH·清除率均呈显著正相关。从酚类物质与抗氧化活性的相关程度来看,3种酚类物质与总抗氧化活性、总还原力、·OH清除率三者的相关系数均表现为原花青素>总酚>总黄酮;与DPPH·清除率的相关系数表现为总酚>总黄酮>原花青素。综上可见,欧李果实各酚类物质含量之间关联紧密,同时抗氧化活性指标、可滴定酸含量及果肉色三者基本均与欧李果实各酚类物质含量存在不同程度的相关性(表2)。

表2 欧李果实不同品质性状相关性分析

2.3 欧李优系资源品质性状间的主成分分析

基于36份欧李优系资源9项指标的主成分分析(表3),由表3可知,共划分3个主成分(F1～F3),贡献率分别为46.21%、15.13%和12.20%,累计贡献率达73.54%;同时3个主成分的特征值均大于1,其中F1的提取特征值为4.159。提取的3个主成分可反映优系材料品质性状73.54%的信息,可作为评价欧李优系资源品质性状的重要指标。由表4可知,F1主要由载荷因子分别为0.870、0.811、0.843、0.776、0.643、0.781和0.539的总酚、总黄酮、原花青素、总还原力、·OH清除率、DPPH·清除率和果肉色决定,称为酚类因子;F2主要由载荷因子为0.873的可滴定酸含量决定,称为酸度因子;F3主要由载荷因子为0.898的总抗氧化活性决定,称为总抗氧化因子。综上所述,总酚、总黄酮、原花青素、总抗氧化、总还原力、·OH清除率、DPPH·清除率、酸度和果肉色可作为评价欧李优系资源品质性状的重要指标。

表3 主成分特征值、贡献率及累计贡献率

表4 因子载荷矩阵

2.4 品质性状的主成分得分和综合评价

根据主成分分析中提取的3个主成分进行得分综合评价,先建立欧李种质综合评价数学模型:F=[10×(46.213×F1+15.132×F2+12.197×F3)/73.542]+60,通过公式计算欧李种质品质性状的综合得分,由高到低进行优良排序,综合得分越高,欧李优系种质综合性状越好,结果见表5。排名在前10的欧李优系由高到底分别为MY37、MY36、MY50、MY47、MY5、MY38、MY17、MY41、MY16和MY1,综合得分范围是66.45～84.53。上述10个优系中有6个总酚含量均在900 mg/(100 g)以上;8个优系总黄酮含量在500 mg/(100 g)以上;6个优系原花青素含量在400 mg/(100 g)以上;抗氧化力突出,同时果肉色基本均为红色。排名前10的欧李优系综合表现优异(表6)。排名在后10的优系资源综合得分范围是29.61～52.46,由低到高分别为MY9、MY10、MY19、MY20、MY6、MY51、MY30、MY12、MY18、MY2。此部分资源酚类物质含量较低,抗氧化能力较差,果肉色大多为浅红和桔黄,综合表现差。

表6 排名前10的欧李优系资源各指标信息

2.5 欧李优系资源的聚类分析及评价

采用欧氏距离法对标准化后的9个指标进行系统聚类分析,最终将36份欧李优系资源划分为4大类(图1)。

图1 36种欧李优系资源系统聚类谱系图

由表7和表8可知,第Ⅰ类群中的优系共7个,分别为MY5、MY36、MY37、MY38、MY41、MY47、MY 50,占比19.44%,均在综合得分排名的前10位之列;第Ⅱ类群中的优系最少,仅1个,为MY40。

表7 3类欧李优系资源各指标均值差异性分析

表8 36种欧李优系资源聚类结果

第Ⅰ、Ⅱ类群均具有各酚类物质含量高及综合抗氧化能力强的特点,果肉色多为红色,主要区别在于第Ⅱ类群的MY40,可滴定酸含量更低,为1.31%。第Ⅲ类群中的优系资源共25个,占比最高,为69.44%,此类群具有各酚类物质含量及综合抗氧化能力适中,可滴定酸含量偏高的特点。第Ⅳ类群中的优系资源共3个,分别为MY6、MY9、MY10,占比8.33%,此类群具有各酚类物质含量偏低、综合抗氧化能力较弱及可滴定酸含量高的特点,果肉色为浅红和桔黄。

3 讨 论

实生选种是对种子实生繁殖后产生的变异进行选择,从而筛选出性状优异的优良种质资源,是植物优良种质资源筛选及新品种培育的主要方式[21]。欧李具有早果特性,实生选种亦作为欧李优良种质资源筛选及进一步新品种选育的常用途径[22]。遗传多样性是欧李新品种选育的基础,本研究对实生选种选出的36份欧李优系资源果实酚类物质、抗氧化性、酸度及果肉色4类品质性状的9个指标变异系数及相关性进行分析,结果表明,9个指标变异系数范围为5.91%～31.03%,36份优系资源品质性状间存在丰富的遗传多样性,其中总黄酮和总抗氧化的变异系数较高。3种酚类物质均与总还原力、DPPH·清除率、·OH清除率和果肉色存在正相关关系,与酸度的相关系数均为负值,三类品质性状与酚类物质均存在着紧密的联系。牛帅科等[23]在葡萄上,严娟等[24]在桃果肉上也发现果肉色与酚类物质有类似的关系。综上,研究的9项指标可以作为欧李优良种质筛选及品种选育的重要参考指标。

通过主成分分析法将9项品质性状指标转化为彼此独立的3个指标,分别为酚类因子、酸度因子和总抗氧化因子。结合相关性分析结果,总抗氧化活性与酚类物质相关性较其他3个抗氧化指标较差,同时又被划分为独自的主成分,可知总抗氧化受果实中其他物质影响较大,如维生素C等。基于提取的3个主成分及建立的欧李种质综合评价数学模型:F=[10×(46.213×F1+15.132×F2+12.197×F3)/73.542]+60, 对36份欧李优系进行综合得分评价。排名前10的优系资源酚类物质含量高,抗氧化能力强,果肉多为红色;后10位的优系资源酚类物质含量低,抗氧化能力较弱,果肉多为桔黄和浅红色,不宜作为高酚类欧李种质资源。

本试验以9项品质指标为参数通过系统聚类将36份优系资源聚为4大类:第Ⅰ类群包括MY5、MY36、MY37、MY38、MY41、MY47、MY50,为酚类物质积累型,多为红果肉,此类群可作为高酚类欧李种质资源及进行后续研究及应用;第Ⅱ类群为MY40,与前一类群主要区别在于酸度,MY40可滴定酸含量更低,为1.31%,可作为特异的低酸高酚种质资源进行后续研究;第Ⅲ类群中的优系资源共25个,此类群具有各酚类物质含量及综合抗氧化能力适中,可滴定酸含量偏高的特点;第Ⅳ类群包括MY6、MY9、MY10,此类群酚类物质含量低,抗氧化能力弱,可滴定酸含量高,果肉色多为浅红和桔黄,此类群不宜作为高酚类欧李种质资源,但可作为高酸低酚种质资源用于其他研究。

4 结 论

本研究差异性及相关性分析表明,36份欧李优系资源的4类品质性状联系紧密,遗传多样性丰富。主成分分析将9个品质性状指标归为累计贡献率达73.54%的3个主成分,分别为酚类因子、酸度因子和总抗氧化因子。通过建立的种质综合评价数学模型,筛选出酚类品质优异的优系资源10份,分别为MY37、MY36、MY50、MY47、MY5、MY38、MY17、MY41、MY16和MY1。通过系统聚类分析,最终聚为4大类,第Ⅰ类群包括7份优系资源,分别为MY5、MY36、MY37、MY38、MY41、MY47、MY50,为酚类物质积累型,多为红果肉,同时这7份优系资源综合得分均在前10位,此类群可作为高酚类品质欧李种质资源。