柱前衍生化HPLC 法测定植物水解蛋白中的17 种氨基酸

陈建芳，江学文，梁 科，王莹莹

（1.华南师范大学 生命科学学院，广东广州 510631；2.广东达元绿洲食品安全股份有限公司，广东广州 510631）

酱油是我国传统调味品，根据《酱油卫生标准》（GB 2717—2003），酱油分为酿造酱油和配制酱油[1]。酿造酱油是以大豆或脱脂大豆、小麦或麸皮为原料，经微生物发酵酿制成的具有特殊色、香、味的液体调味品[2]。配制酱油是以酿造酱油为主体，与酸水解植物蛋白调味液、食品添加剂等配制而成的液体调味品[3]。酸水解植物蛋白调味液（Hydrolyzed Vegetable Protein，HVP）是指以含有食用植物蛋白的脱脂大豆、花生粕、小麦蛋白或玉米蛋白为原料，经盐酸水解、碱中和制成的液体鲜味调味品[4]。酸水解植物蛋白调味粉（HVP 粉）是HVP 经离心喷雾干燥而制成。根据《食品安全国家标准 酱油》（GB 2717—2018），酱油是指酿造酱油[5]。2021 年6 月，国家市场监督管理总局发布《关于加强酱油和食醋质量安全监督管理的公告》，指出酱油生产企业不得再生产销售标示为“配制酱油”的产品，不得使用酸水解植物蛋白调味液等原料配制生产酱油。但不法商人为获取更多利益，使用配制酱油冒充酿造酱油，给消费者带来安全风险，因此鉴别酿造酱油和配制酱油具有重要的现实意义。本研究利用2,4-二硝基氟苯柱前衍生HPLC 法测定HVP 中游离氨基酸，以期为酿造酱油与配制酱油的鉴别提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸水解植物蛋白粉（HVP 粉），上海爱普食品工业有限公司（以下简称爱普HVP 粉）；酸水解植物蛋白粉（HVP 粉），河南新乡科兴添加剂有限责任公司（以下简称科兴HVP 粉）；复合酸水解植物蛋白调味液（HVP），保定味佳调味品有限公司（以下简称味佳HVP）；厨邦酱油特级鲜生抽（酿造酱油）、海天金标生抽（酿造酱油）、李锦记精选老抽（酿造酱油）、海天鲜味生抽（酿造酱油），购于超市；17 种氨基酸混标，购自中国计量研究院，浓度为1.0 mmol·mL-1；17 种氨基酸单标，上海麦克林生化科技有限公司；2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯），天津市四友精细化学品有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪，Agilent 1260，美国Agilent 公司；DiamonsilAAA 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），北京迪科马科技有限公司；数控超声波清洗器，KH-500B，昆山市超声仪器有限公司；电热恒温水浴锅，HHS-11-2，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；循环水真空泵，SHZ-D（III），巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

氨基酸混合标准系列溶液的制备：用0.1 mol·L-1稀盐酸将17 种氨基酸混标溶液（每种氨基酸浓度均为1.0 mmol·L-1）稀释成不同浓度梯度的混合系列标准溶液。

1.3.2 样品处理

用水将HVP 粉稀释30 倍后，再用0.1 mol·L-1盐酸将其稀释5 倍；用水将HVP 和酱油稀释10 倍后，再用0.1 mol·L-1盐酸将其稀释5 倍。

1.3.3 衍生化

吸取100 μL 氨基酸混标溶液、HVP 处理液或酱油稀释液，加入2 mL 离心管中，加入100 μL 0.1 mol·L-1Na2B4O7水 溶 液 和100 μL 1% DNFB 乙腈溶液，盖紧摇匀，于60 ℃恒温水浴锅中避光反应1 h。反应完毕后将试管置于冷水中冷却，加入0.02 mol·L-1Na2HPO4和0.02 mol·L-1NaH2PO4水溶液定容至1 mL，混匀后，用0.45 μm 有机膜过滤，待测。

1.3.4 仪器条件

色谱柱柱温：45 ℃；检测波长：360 nm；进样体积：10 μL；流速：1.0 mL·min-1；流动相A 为0.02 mol·L-1Na2HPO4+0.02 mol·L-1NaH2PO4水溶液；流动相B 为甲醇∶乙腈=10 ∶90（V∶V）；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.3.5 数据分析

利用Excel 2019 软件进行数据计算与处理。

2 结果与分析

2.1 线性关系、检出限及定量限测定结果

由图1 可知，17 种氨基酸混标溶液中各氨基酸能有效分离，峰型正常，表明色谱方法适合氨基酸的测定。以氨基酸对照品峰面积（y）对进样氨基酸浓度（x，mg·L-1）绘制标准曲线，得回归方程。信噪比（S/N）计算检出限和定量限，S/N=3 ∶1 时的氨基酸浓度为检出限，S/N=10 ∶1 时的氨基酸浓度为定量限结果，见表2。除酪氨酸相关系数大于0.99 外，其余氨基酸相关系数均大于0.999，检出限为0.110 ～1.812 mg·L-1，定量限为0.329 ～3.624 mg·L-1，表明仪器灵敏度高。

图1 17 种氨基酸混标色谱图

表2 17 种氨基酸的标准曲线、相关系数、检出限和定量限

2.2 精密度、重复性、稳定性和加标回收实验结果

2.2.1 精密度实验结果

精密吸取氨基酸混合对照品溶液（0.25 mmol·mL-1），连续进样6 次，测定各氨基酸的含量并计算其RSD。测得天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和酪氨酸含量的RSD 分别为1.87%、0.20%、0.42%、0.34%、0.30%、1.74%、0.28%、0.25%、0.19%、0.18%、0.11%、0.54%、0.49%、0.48%、0.22%、0.31%和1.02%，说明该仪器精密度良好。

2.2.2 重复性实验结果

分别称取6 份爱普HVP 粉，按“1.3.2”和“1.3.3”制备溶液并衍生化，在“1.3.4”色谱条件下连续进样6 次，测定各种氨基酸的含量并计算其RSD，爱普HVP 粉色谱图见图2。测得爱普HVP 粉天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和酪氨酸含量的RSD 分别为4.11%、4.21%、3.44%、2.75%、0.44%、0.57%、1.50%、2.53%、3.64%、3.86%、1.28%、0%、6.07%、3.97%、3.63%、2.46%、1.85%，说明该方法重复性良好。

图2 爱普HVP 粉色谱图

2.2.3 稳定性实验结果

分别称取3 份爱普HVP 粉，按“1.3.2”和“1.3.3”制备溶液并衍生化，在“1.3.4”色谱条件下，分别于0 h、24 h、48 h 进样测定，记录峰面积，计算氨基酸含量及其RSD。测得爱普HVP 粉天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和酪氨酸含量的RSD 分别为4.62%、3.13%、3.96%、4.46%、1.51%、2.79%、2.63%、3.32%、1.33%、4.09%、2.15%、3.24%、3.74%、3.58%、1.64%、1.51%、1.10%，表明样品在室温条件下48 h 内稳定性良好。

2.2.4 加标回收实验结果

称取3 份爱普HVP 粉，精密加入与样品中待测成分含量相当的氨基酸混合溶液，按“1.3.2”和“1.3.3”制备溶液并衍生化，按“1.3.4”色谱条件测定，计算氨基酸含量并计算其RSD。由表3 可知，爱普HVP 粉17 种氨基酸的平均加标回收率为86.17%～105.81%，RSD 为0.15%～9.39%，说明该方法准确度高。

表3 加标回收实验结果（n=3）

2.3 植物水解蛋白与酿造酱油氨基酸测定结果对比

由表4 可知，HVP 粉和HVP 氨基酸组成相似，其中谷氨酸占比相差较大，是因为HVP 粉中加入了谷氨酸钠。HVP（粉）氨基酸组成与酿造酱油差异明显，均以谷氨酸占比最高，这与原料中蛋白质的氨基酸比例有关，有研究表明，大豆和豆粕蛋白质中谷氨酸含量均最高[6-7]。HVP（粉）中谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸以及脯氨酸百分含量与酿造酱油差异较大，HVP（粉）中谷氨酸占比均低于45%，酿造酱油中谷氨酸含量均超过45%，尤其是厨邦酱油特级鲜生抽谷氨酸占比达75.01%；HVP（粉）中天冬氨酸占比均超过7%，而酿造酱油中天冬氨酸的占比均低于5%，尤其是厨邦酱油特级鲜生抽中天冬氨酸含量仅为1.11%；HVP（粉）中精氨酸占比均超过4.5%，尤其是味佳HVP 液中精氨酸占比高达11.24%，而酿造酱油中精氨酸的占比均低于2.5%；HVP（粉）中甘氨酸占比均超过3.5%，而酿造酱油中甘氨酸的占比均低于1.7%；HVP（粉）中脯氨酸占比均超过5%，尤其是味佳HVP 液中脯氨酸占比高达9.74%，而酿造酱油中脯氨酸的占比均低于2.5%。HVP（粉）中天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸和脯氨酸含量较高，与它们在原料豆粕中的高含量及它们在HVP 中的释放率高于90%有关[6-8]。

3 结论

本文构建了2,4-二硝基氟苯-柱前衍生HPLC法测定HVP 中17 种氨基酸含量的方法，该方法操作简便，精密度、重复性、稳定性、准确度高，可作为HVP 中氨基酸含量的测定方法。植物水解蛋白与酿造酱油中的氨基酸组成差异较大，尤其是谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸以及脯氨酸，植物水解蛋白中谷氨酸占比低于酿造酱油，而天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸以及脯氨酸明显高于酿造酱油，可为酿造酱油与配制酱油的鉴别提供一定依据。