绿萼凤仙花和滇水金凤MYB61基因克隆及表达分析

向南星 李泽凤 李新艺 魏春梅 黄美娟 黄海泉

关键词：绿萼凤仙花；滇水金凤；MYB61；木质素；表达分析

在低等植物向高等植物进化过程中，植物木质化是适应陆地环境的关键表现之一[1]；木质化是指木质素单体氧化聚合形成的木质素在细胞壁上沉积，使植物细胞壁增厚的过程[2]；木质素的沉积过程一般发生在次生木质部，具有增强植物的机械支撑力、保障植物体内的营养物质长距离运输及提高生物及非生物胁迫能力等功能[3-6]。近年来，随着分子生物学、基因组学和蛋白组学等方面的发展，植物木质化的分子调控机制已得到深入的研究。木质素作为植物生长发育过程中的一种次生代谢产物，其合成受转录因子和激素酶等制约；其中MYB、NAC和WRKY类转录因子家族主要参与调控木质素生物合成和其他次级细胞壁形成的相关途径[7-8]；尤以MYB类转录因子在此过程中发挥直接且重要的调控作用。

MYB家族作为植物中最大轉录因子家族之一，其主要调节植物的生长发育过程，如代谢调节、生物和非生物的应激响应、细胞分裂和细胞周期的控制等[9]。MYB家族基因均含有一段高度保守的MYB结构域[10]；根据MYB结构域的数量和基序重复类型及个数不同，将其分成1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB[11]。研究表明，R2R3-MYB广泛参与苯丙烷类代谢途径，如调控木质素的生物合成、次生代谢和细胞分裂等方面[12]。研究发现源自拟南芥的AtMYB61属于R2R3-MYB类转录因子，主要参与调控植物木质部木质化和气孔孔径等方面[13-15]；源自神农香菊的CiMYB61基因在烟草中过表达时，发现转基因烟草的茎和叶中的木质素含量显著增加[16]；在拟南芥中过表达AtMYB61会使木质素异位沉积[13-14]；且MYB61是调控水稻细胞壁中纤维素合成的显性因子之一[17-18]；综上，MYB61基因参与调控了植物木质素的生物合成。

我国凤仙花属（ImpatiensL.）植物资源极为丰富，约有270余种，且主要分布于中国西南地区[19]；根据凤仙花对水分的依赖程度，主要分为水生、湿生和陆生三大类型，且不同类型凤仙花的木质化程度存在较大差异[20]。绿萼凤仙花（Impatienschlorosepala）和滇水金凤（Impatiensuliginosa）主要分布在云南省和贵州省，因花型独特、分枝能力强和花期长等特点，可作为园林植物予以开发利用[21]；绿萼凤仙花生长于山谷溪水或疏林旁，其茎匍匐肉质且含水量大，属于典型的湿生凤仙花；滇水金凤主要在水中生长，其茎直立且空心，易倒伏，属于典型的水生凤仙花。滇水金凤和绿萼凤仙花木质化的研究不仅能对该属植物从水生到陆生的适应机制作出相应判断，还有助于培育更健壮的凤仙花植株。目前，尚无滇水金凤和绿萼凤仙花木质素相关基因MYB61的报道。本研究以绿萼凤仙花和滇水金凤为试验材料，分离克隆MYB61基因，并对其序列进行生物信息学及系统发育分析；采用qRT-PCR阐释其在这2种凤仙花的3个不同部位2个时期的时空表达模式，结合木质素总含量的测定结果，进而探讨MYB61基因在绿萼凤仙花和滇水金凤木质素生物合成中的功能与作用，为后期进一步探究不同凤仙花木质化差异及新品种培育提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1材料

供试材料为绿萼凤仙花和滇水金凤，绿萼凤仙花种植于西南林业大学的树木园中，滇水金凤采摘于昆明市捞鱼河公园。采取这2种凤仙花幼苗期和成熟期地下5cm处的根、距顶端的第5片叶和地上5cm处的茎杆。

1.2方法

1.2.1总RNA的提取与MYB61基因的克隆按照RNA提取试剂盒（OMEGA）操作步骤提取绿萼凤仙花和滇水金凤茎的总RNA；再使用逆转录试剂盒（全式金）将RNA合成cDNA，并将其置于–20℃冰箱备用。利用本课题组的转录组数据设计引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用cDNA模板和引物对MYB61基因进行PCR扩增，其体系为50.0μL。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性50s，58℃（IuMYB61）/59℃（IcMYB61）退火1min，72℃延伸1min，36个循环；72℃延伸10min；PCR产物回收纯化后连接到pMD19-T载体，并转化DH5α感受态细胞，筛选阳性菌液交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.2MYB61基因的生物信息学分析IcMYB61和IuMYB61基因的理化性质通过ExPASy在线软件（https：//web.expasy.org/protparam/）进行分析；利用SMART在线软件（http：//smart.embl-heidelberg.de/opennewwindow）对其结构域进行分析预测，再使用CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对它们的超级家族进行预测。通过NCBI数据库Blast工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）查找同源性高的序列，再用DNAMAN9.0软件完成序列的多重比对及同源性分析；在MEGA-X软件上构建系统发育树。

1.2.3MYB61基因的表达特性分析提取绿萼凤仙花和滇水金凤在幼苗期和成熟期根、茎和叶的总RNA，逆转录合成cDNA。通过Primerdesigningtool.nih.gov网站设计IcMYB61基因的荧光定量引物（表2）。参照丁爱琴等[22]的内参基因的2–ΔΔCT法，对每个部位进行3次生物重复，将根作为对照，计算出MYB61基因在2个不同时期绿萼凤仙花和滇水金凤的3个不同部位中的相对表达量，利用SPSSStatistics25软件对得到的相对表达量数据进行显著性分析，再使用Origin2021软件对分析结果作直观视图。

1.2.4木质素含量的测定将成熟期绿萼凤仙花和滇水金凤整株的新鲜的茎和叶在60℃下烘干至恒重，每个样品3次重复，详细步骤参照胡慧贞[23]的木质素含量测定方法，得到木质素酸溶和酸不溶的总含量，使用SPSS软件进行数据分析。

2结果与分析

2.1MYB61基因的克隆

以绿萼凤仙花和滇水金凤的cDNA为模板，经RT-PCR扩增后得到目的片段（图1），将结果序列与转录组数据比对发现，序列一致，分别将其命名为IcMYB61（登录号：OP490310）和IuMYB61（登录号：OP490311）；将其cDNA序列与gDNA序列全长比对发现，IcMYB61和IuMYB61基因均由2个外显子和1个内含子构成，均在上游，其内含子长度分别为84bp和66bp（图2）。

2.2MYB61基因的理化性质分析

利用ExPasy-ProtParam在线软件对绿萼凤仙花和滇水金凤MYB61基因进行分析（表3），IcMYB61和IuMYB61全长分别为1035bp和1002bp，分别编码344aa和333aa；不稳定指数分别为67.67和65.89，其数值高于40，故IcMYB61和IuMYB61均为不稳定蛋白；总平均亲水指数分别为–0.728和–0.716，其数值均低于0，推测IcMYB61和IuMYB61为亲水性蛋白。

2.3MYB61基因的结构域及系统进化分析

绿萼凤仙花和滇水金凤MYB61基因的结构域与保守域预测结果表明，IcMYB61和IuMYB61基因的2个典型SANT保守结构域均在13～63和66～114位氨基酸之间（图3）。通过DNAMAN9.0软件对试验的IcMYB61和IuMYB61与其他物种MYB61基因进行氨基酸同源序列比对分析（图4），结果发现，IcMYB61和IuMYB61基因与其他植物的氨基酸序列的一致性为56.7%，且同源性主要在N端较高，C端的一致性较低，说明绿萼凤仙花、滇水金凤和其他物种的MYB61基因在C端的差异均较大。

利用MEGA-X软件的邻接法（neighbor-joining，NJ），根据绿萼凤仙花和滇水金凤MYB61及其他MYB61同源物种的氨基酸序列，从1000个重复中推导出bootstrap共识树，并构建IcMYB61和IuMYB61基因与其他MYB61基因同源物种的系统发育分析树，从图5可以看出IcMYB61和IuMYB61基因与喜马拉雅凤仙花MYB61基因聚为一个大支，IuMYB61基因与喜马拉雅凤仙花（ImpatiensglanduliferaXP047337748.1）的同源性较IcMYB61更高，说明IuMYB61与喜马拉雅凤仙花的亲缘关系更近，在一定程度上可以证明同一个属的亲缘关系更近。

2.4MYB61基因的表达分析

通过qRT-PCR检测IcMYB61和IuMYB61基因分别在绿萼凤仙花和滇水金凤的不同部位中的表达情况，从图6可以看出，IcMYB61和IuMYB61基因在绿萼凤仙花和滇水金凤的根、茎和叶3个部位（根、茎和叶）及2个不同时期（幼苗期、成熟期）中均有表达。IcMYB61和IuMYB61基因均在2个时期的根中表达量最低，在成熟期的茎中表达量最高；IcMYB61基因在绿萼凤仙花幼苗期的叶中表达量最高，茎次之，而在成熟期的茎中表达量最高，叶次之。IuMYB61基因在滇水金凤2个时期均表现出在茎中的表达量最高，叶次之；上述结果表明IcMYB61和IuMYB61基因主要在成熟期的茎和幼苗期的茎和叶中发挥作用。

2.5木质素总量变化分析

从表4中发现，在滇水金凤和绿萼凤仙花的茎和叶的木质素总含量存在显著差异（P<0.05），经对比分析发现，茎的木质素总含量均明显高于叶的木质素含量，且在滇水金凤中表现更为显著；由于滇水金凤的茎为直立茎，绿萼凤仙花的茎为匍匐茎，说明木质素的含量与茎的直立程度有关。

3讨论

MYB是对植物生长发育过程中影响最大的家族之一，自PAZ-ARES等从玉米（Zeamays）中克隆出首个与类黄酮合成的MYB转录因子C1（Colorless1）后[24]，不同植物中的MYB类转录因子相继被克隆，并对其功能进行探究及分析；目前MYB61基因在水稻（Oryzasativa）、神农香菊（Chrysanthemumindicumvar.aromaticum）和模式植物拟南芥（Arabidopsisthaliana）等植物中已有研究，其功能主要涉及到纤维素的合成和木质化的异位沉积等[13，16-17]。本研究通过克隆获得了绿萼凤仙花和滇水金凤的MYB61基因，其cDNA全长分别为1035bp和1002bp；基因分别编码344aa和333aa，且都有一个内含子，均为不稳定亲水性蛋白，与白桦MYB61的研究结果一致[25]；CDD分析结果表明IcMYB61和IuMYB61具有2个典型的SANT结构域，与ZHANG等[26]和BOYER等[27]的研究结果相似，与R2R3-MYB亚家族的基本结构研究相吻合[28]，推测IcMYB61基因属于R2R3-MYB家族；系统发育树分析发现，IcMYB61和IuMYB61基因与喜马拉雅凤仙花聚为一支，验证了同一属的亲缘关系最近。

植物细胞在所有细胞中都能合成初级细胞壁（primarycellwall，PCW），但只有在特定类型的细胞中才能产生次级细胞壁（secondarycellwall，SCW），如双子叶植物中的木质部导管和纤维，它们可以传导水分和提供机械支持[29]；而这些SCW特异性生物聚合物的合成需要由SCW特异性转录因子来调控[30]；有研究发现神农香菊CiMYB61在烟草中过表达时，叶和茎的硬度显著增加，且转基因株系的木质素含量增加30%～45%[16]；MYB61基因在水稻中过表达也出现植株木质化现象[18]；MYB61在芒草中被认为是直接调控木质素单体形成的基因，能直接激活C4L、CCR和HCT等调控木质素合成的相关基因的表达[17]，MYB61调控木质素合成功能基因在其他单子叶和双子叶植物中也有报道[30-31]。综上所述MYB61在促进木质素合成过程中发挥了重要作用。已有研究表明MYB61在大部分植物中均有表达，且在不同植物的不同部位的表达量差异较大，主要在茎和叶中的表达量更高[16，25]；本研究的qRT-PCR分析结果发现，IcMYB61和IuMYB61在2个时期的根、茎和叶中均有表达，在幼苗期和成熟期的根中的表达量均最低，但均在成熟期的茎中表达量最高，与白桦等植物的研究结果一致[16]，推测MYB61主要在凤仙花的茎中发挥作用。幼苗期时，MYB61基因在绿萼凤仙花中叶的表达量最高，而滇水金凤茎的表达量高于叶，这可能是由于在幼苗期滇水金凤的直立茎比绿萼凤仙花的匍匐肉质茎的木质素含量更高；在成熟期时，MYB61基因在绿萼凤仙花和滇水金凤中，茎的表达量均最高，和本研究的木质素总含量趋势一致，这与神农香菊的研究结果一致[25]；可以推测IcMYB61和IuMYB61基因在绿萼凤仙花和滇水金凤的木质化生物合成中发挥了重要作用，但其具体功能及作用机理还有待于进一步的转基因功能验证。

本研究发现IcMYB61和IuMYB61基因属于凤仙花中的R2R3-MYB亚家族成员，同时对其在绿萼凤仙花和滇水金凤的不同时期不同部位的时空表达模式及相关木质素的含量进行了分析，推测IcMYB61和IuMYB61基因均在木质素生物合成中发挥重要作用，在一定程度上为探究鳳仙花木质素合成的分子机制提供了一定的基础数据，而且为凤仙花品种改良及创新提供一定的理论依据。