氨氮对大口黑鲈北方亚种引进种F1代幼鱼急性毒性及生理变化的影响

唐忠林，张佳佳，周国勤，强 俊，徐 跑，徐钢春，王佩佩，庆 辉

(1.南京市水产科学研究所，南京 210036；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏无锡 214000)

目前，国内养殖的大口黑鲈(Micropterussalmoides)主要包括优鲈1号、优鲈3号和未选育的普通鲈，同时研究表明，由于多代选育，国内养殖群体的多态位点比例和遗传多样性均有所下降[9]，这使得大口黑鲈种质资源弱化，可能会引起病害等相关的养殖问题，因此有必要通过引进其他遗传多样性高、遗传改良潜力大的群体作为补充来改良我国大口黑鲈种质。鉴于此，南京市水产科学研究所联合中国水产科学研究院淡水渔业研究中心2019年从美国引进大口黑鲈北方亚种原种。有报道称未进行过选择育种的加州原种可能存在遗传瓶颈，易导致遗传多样性降低[9]，因此要对引进种进行选育，来保持遗传多样性的稳定。在开展选育工作之前十分有必要了解加州原种子代对养殖水体环境的要求，以及对氨氮的耐受能力。因此，本试验通过探究在急性氨氮胁迫下大口黑鲈北方亚种引进种F1代(简称“引进种F1代”)一些生物指标的变化，旨在综合分析氨氮对该品种的毒理作用，为苗种生产提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用大口黑鲈北方亚种引进种F1代幼鱼体质量(12.51±0.91)g、体长(9.03±0.34)cm，是南京市水产科学研究所自2019年从美国引入的北方亚种原种繁育所得。将实验用鱼暂养于有生物过滤水再循环系统(配备有冷却和加热功能，流速为5 L/min，光照时间为14 h)的水族箱中。每天投喂两次(8：00～9：00和20：00～21：00)江苏南京帅丰饲料有限公司大口黑鲈配合饲料。整个暂养和实验期间水中溶氧高于6.5 mg/L，氨氮与亚硝酸盐低于0.01 mg/L，水温为27 ℃，实验前禁食24 h，实验期间不投喂。

1.2 氨氮胁迫 96 h LC50 实验

采用96 h静水式试验法对北方亚种引进种F1代进行氨氮毒性预试验。用干燥分析纯晶体NH4Cl配制不同浓度的氨氮溶液，确定24 h未见死亡的最大氨氮浓度(20 mg/L)和全部死亡的最小氨氮浓度(40 mg/L)。

再根据预试验结果以等对数间距设置正式试验的7组氨氮浓度(0、20.98、23.71、26.79、30.27、34.21、38.65 mg/L)，每个浓度设置3个重复，每组放入20尾鱼苗，分别记录24、48、72和96 h死亡尾数，试验期间24 h换水一次，保持溶氧高于6 mg/L，pH为7.3，水温为28 ℃。

1.3 氨氮胁迫实验

依据氨氮胁迫96 h LC50，设置对照组(0 mg/L)与实验组(18 mg/L)，实验组与对照组设置3个重复，选取体质量相近、活性良好的幼鱼60 尾随机放置于3个养殖桶中(80 L)，每桶20尾。分别于胁迫后第0、6、12、24、48和 96 h在每个浓度组中随机取样。每次每个重复随机取2尾鱼麻醉后解剖，迅速取出脑、鳃和肝组织置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 组织酶活性检测

分别于胁迫后第0、6、12、24、48和 96 h在每个浓度组中随机取3尾鱼，取鳃组织0.1 g加入0.9 mL的生理盐水，冰水浴匀浆，2 500 r/min 离心10 min取上清液，按照说明书测定蛋白浓度、Na+/K+-ATP酶。试剂盒均采自南京建成生物工程研究所。

1.5 组织RNA的提取与 cDNA的合成

组织RNA的提取采用高纯总RNA快速抽提试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司，RP1202)，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量(电压120 V，电流165 mA，时间25 min)，用Nanodrop 检测 RNA 的纯度(OD260 nm/260)和浓度。根据HiScript®Reverse Transcriptase的说明(Vazyme，R123-01)进行第一链cDNA反转录。

1.6 荧光定量PCR

参考陆健等[10]引物序列(详见表1)。用SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed)试剂盒(Vazyme，Q341-02/03)在ABI荧光定量PCR仪扩增。反应体系：2 μL cDNA模板(5 ng/μL)，4 μL的上、下游引物(10 μmol/L)，10 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed)。扩增条件为预变性95 ℃，10 min；40个循环反应(95 ℃，10 s；58 ℃，60 s)。每个样品重复3次。

1.7 数据统计与分析

非离子氨的计算公式如下：

NH3=TAN/[1+10(pKa-pH)]

pKa=0.090 18+2 729.92/T(T=273+t，T为开氏温度，t为实验时水温)

安全质量浓度(SC)=96 h LC50/10

通过SPSS 25.0软件的分析—回归—Probit分别计算得出24、48、72和96 h的LC50。实时荧光定量PCR分析后的实验结果数据采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。实验所得数据均用平均值±标准差的方式表示，所有数据均用 SPSS 25.0统计分析。利用单因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD多重比较检验对同一时间不同浓度组间，以及同一浓度不同时间进行数据处理和检验分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，用Origin 8.6绘图。

2 结果与分析

2.1 氨氮对引进种F1代幼鱼的急性毒性影响

氨氮对引进种F1代幼鱼的急性毒性结果见表2。在相同的氨氮浓度下，幼鱼死亡率随氨氮胁迫时间的延长而升高；在相同的氨氮胁迫时间下，幼鱼死亡率随水体中氨氮浓度的升高而升高。经96 h氨氮胁迫后，20.98 mg/L和23.71 mg/L两组的死亡率低于50%，其余组的死亡率均高于50%，其中34.21 mg/L和38.65 mg/L组的试验鱼全部死亡。

表2 不同氨氮浓度胁迫对大口黑鲈北方亚种引进种F1代幼鱼死亡率的影响Tab.2 Effects of different ammonia nitrogen concentrations on the mortality for the introduction of M.salmoides F1 juvenile

通过回归分析得出引进种F1代幼鱼24、48、72、96 h的半致死浓度分别为33.66、29.86、26.98、25.08 mg/L；非离子氨半致死浓度分别为0.46、0.41、0.37和0.34 mg/L。氨氮安全浓度为2.51 mg/L，非离子氨的安全浓度是0.034 mg/L。

2.2 氨氮胁迫对引进种F1代幼鱼鳃组织Na+/K+-ATP酶活力的影响

由图1可知，与对照组相比，氨氮胁迫后鳃组织中Na+/K+-ATP酶呈先降低再升高的变化趋势，胁迫12 h时达到最低值，且与对照组差异显著。随后开始上升，胁迫48 h时达到最高值，且与对照组差异显著，为对照组的2.22倍。胁迫96 h时又恢复至对照组水平。

图1 氨氮胁迫对大口黑鲈北方亚种引进种F1代幼鱼鳃组织Na+/K+-ATP酶的影响Fig.1 Effects of ammonia-N stress on the Na+/K+-ATPase in gills for the introduction of M.salmoides F1 juvenile不同字母表示不同时间的数据间有显著性差异(P<0.05)；*表示与对照组同一时间数据有显著性差异(*：P<0.05，**：P<0.01)；后同此。

2.3 氨氮胁迫对引进种F1代幼鱼hsp70基因表达的影响

由图2和图3可知，与对照组相比，氨氮胁迫后肝和鳃组织中hsp70 mRNA表达量均呈先升高再降低的变化趋势，都在胁迫6 h时达到最大值，分别为对照组的2.52和7.48倍，且与对照组差异显著，随后开始下降，肝组织hsp70 mRNA表达量在胁迫24 h时降至对照组水平；而鳃组织在胁迫24 h时仍显著高于对照组。48～96 h胁迫组肝和鳃组织hsp70 mRNA表达量均显著低于对照组。由图4可知，与对照组相比，氨氮胁迫后脑组织中hsp70 mRNA表达量在0 h时表达量最高，并随着时间的延长持续下降，在胁迫6 h时就显著低于对照组，直到胁迫24 h以后无显著降低。

图2 氨氮胁迫对大口黑鲈北方亚种引进种F1代幼鱼肝组织hsp70mRNA相对表达的影响Fig.2 The effects of ammonia-N stress on the relative expression of hsp70 mRNA in livers for introduction of M.salmoides F1 juvenile

图3 氨氮胁迫对大口黑鲈北方亚种引进种F1代幼鱼鳃组织hsp70 mRNA相对表达的影响Fig.3 The effects of ammonia-N stress on the relative expression of hsp70 mRNA in gills for introduction of M.salmoides F1 juvenile

图4 氨氮胁迫对大口黑鲈北方亚种引进种F1代幼鱼脑组织hsp70 mRNA相对表达的影响Fig.4 The effects of ammonia-N stress on relative expression of hsp70 mRNA in brains for introduction of M.salmoides F1 juvenile

3 讨论

3.1 氨氮对引进种F1代幼鱼的急性毒性影响

目前有关氨氮对水产鱼类毒性作用的研究较多，本试验结果显示，氨氮对大口黑鲈美国原种幼鱼的急性毒性与氨氮浓度和胁迫时间呈线性关系，随氨氮浓度提升幼鱼死亡率急剧上升，死亡时间缩短，这与大多数鱼类的结果一致[11-13]。在本试验条件(溶氧>6 mg/L，pH=7.3，水温28 ℃)下，大口黑鲈北方亚种引进种F1代对氨氮的安全浓度为2.51 mg/L，高于鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)幼鱼(0.033 mg/L)[14]、鳜(Sinipercachuatsi)幼鱼(0.013 mg/L)[12]、金鱼(Carassiusauratus)(0.028 mg/L)[15]，低于草鱼(Ctenopharyngodonidella)(0.096 mg/L)[16]、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)(0.327 mg/L)[17]、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)(0.074 mg/L)[18]等大多数鱼类，这表明种类不同的鱼对氨氮耐受力有差异。同时，郑洪武[19]的实验表明，在水温 21 ℃、溶解氧 8.0 mg/L、pH 7.9的条件下，体质量为20.02 g的大口黑鲈氨氮安全浓度为6.33 mg/L，高于本实验结果，与本实验结果不同的原因可能是鱼体大小不同，也可能是国内养殖的大多数大口黑鲈经过长期人工养殖驯化已能适应肥沃水质，其对氨氮的耐受力明显增强，而大口黑鲈北方亚种引进种F1代还未经过驯化，暂不能适应国内养殖水体环境中较高的氨氮浓度[19]。这提示我们在大口黑鲈引进种的养殖驯化中要格外关注水体中氨氮含量。同时研究也表明，水体中氨氮毒性会受到水温、pH、溶解氧和盐度等因素的影响，本试验条件下，水体温度的增加，水体中有毒的非离子氨所占的比例提高，导致水体氨氮毒性增强，鱼体对氨氮的安全浓度降低[20-21]。这也提示广大养殖户在高密度养殖的过程中不仅要实时监测水体中的氨氮浓度，还要及时监测水体 pH，尤其在高温天气要及时采取换水降温、调节 pH 及曝气等措施紧急缓解毒性，从而减少经济损失。

3.2 氨氮胁迫对引进种F1代幼鱼鳃组织Na+/K+-ATP酶活力的影响

3.3 氨氮胁迫对引进种F1代幼鱼hsp70基因表达的影响

热应激蛋白(HSPs)是机体细胞受环境刺激诱导而产生的具有高度保守性的一组重要的非特异性细胞保护性蛋白[27]。大量的研究表明HSPs家族基因广泛参与鱼类应激调控机制，当暴露于环境应激中，机体通过激活热休克基因合成HSPs[28]。因此，HSPs被作为鱼类养殖中检测应激程度、应激能力的分子标记[29]。本研究发现，氨氮胁迫后大口黑鲈北方亚种F1代幼鱼肝和鳃组织中hsp70基因的mRNA表达量均在6 h后呈现出显著上升趋势，且达到峰值，表明hsp70基因在氨氮胁迫时可以快速做出应答，通过增加机体hsp70基因的表达水平从而减少H2O2对细胞膜造成的损伤，以达到保护细胞的作用[30]。孙丽颖等[31]对急性氨氮胁迫下黄颡鱼幼鱼HSPs基因表达变化的检测中也获得了类似的结果。同时，郑洪武[19]和杨斯琪[32]用28.5 mg/L和38 mg/L浓度的氨氮胁迫普通大口黑鲈，各个组织中T-SOD、T-AOC、CAT、GSH-Px活性在胁迫初期均有显著升高，印证了氨氮胁迫后会激活体内的抗氧化系统来清除体内的自由基。但是，本试验中经过氨氮胁迫大口黑鲈北方亚种引进种F1代幼鱼脑组织中hsp70基因的mRNA表达量于胁迫发生后均迅速降低，原因可能是大量的氨氮进入体内，导致谷氨酰胺在体内过量积累，使神经胶质细胞肿大，引发脑水肿对脑组织造成了损伤[33]，影响到hsp70基因的转录。但随着胁迫时间的延长，肝、脑、鳃组织中hsp70 mRNA表达量均呈现出下降趋势，这可能是氨氮胁迫持续一定时间，对鱼类的机体造成了氧化损伤和组织损伤，从而破坏了细胞的功能，致使hsp70修复受损DNA和蛋白的能力减弱，变性的蛋白在体内累积，影响正常细胞的代谢能力[34]。同样的，郑洪武[19]的研究发现，氨氮胁迫7 d后，大口黑鲈的肝细胞大面积坏死，肝组织结构受损严重；鳃丝毛细血管破碎，血细胞漫出，鳃腔内充血严重，鳃小片结构消失，这也充分说明机体对氨氮胁迫的调节是有限的。

4 结论

本研究初步表明，在溶氧>6 mg/L，pH=7.3，水温28 ℃的试验条件下，大口黑鲈北方亚种引进种F1代幼鱼的氨氮安全浓度为2.51 mg/L。18 mg/L的氨氮胁迫会对其造成一定应激损伤，在短时间内可以进行自我调节和修复，胁迫时间过长会造成机体的氧化损伤和组织损伤，表现在组织中hsp70mRNA 表达量低于对照组水平。