CRNDE介导miR-33a-5p/CDK6轴影响细胞周期调控人体肝癌细胞增殖的实验研究

梅小平 姚明 周清河 许浏 周鸿鲲 李彦

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）发病率和死亡率高，是我国最常见的恶性肿瘤之一。HCC起病隐匿，早期多无典型症状，临床发现时多已进入肿瘤中晚期，错过了可行根治性手术的最佳时机。即便接受了手术切除，HCC患者5年生存率仍较低［1］。CRNDE（Colorectal neoplasia differentially expressed）具有组织表达特异性，参与了多种肿瘤的发生、发展进程，是肿瘤的潜在治疗靶点［2］。CDK6（cyclin-dependent kinase 6）是影响细胞周期的重要蛋白之一，CDK6过表达可通过多种方式促进HCC的增殖，是细胞信号传导途径中的“中心节点”［3］。通过生物信息学分析，作者发现miR-33a-5p与CRNDE及CDK6均有潜在的结合位点［4］。本研究通过探讨CRNDE介导miR-33a-5p/CDK6轴影响细胞周期调控人体肝癌细胞增殖的作用机制，发现CRNDE能通过靶向调节作用抑制miR-33a-5p的表达，进而介导CDK6的升高，促进肝细胞肝癌的增殖，报道如下。

1 资料与方法

1.1 细胞培养与转染 HL-7702人体肝细胞株和HuH-7人体肝癌细胞株均购于中国科学院上海细胞库。细胞株按期进行传代，维持指数生长。构建稳定干扰CRNDE/低表达CRNDE人体肝癌细胞模型。正义链按5′→3′顺序序列为：酶切位点（Xho I）、干扰序列（21bp）、loop环（TTCAAGAGA）、干扰序列的反向序列、终止信号（TTTTTT）；反义链按5′→3′顺序序列为：酶切位点（BamH I）、终止序列的序列（AAAAAA）、干扰序列（21bp）、环路环的序列（TCTCTTGAA）和干扰序列的反向序列。

1.2 实验分组 HL-7702人体肝细胞组、HuH-7人体肝癌细胞组及稳定干扰CRNDE/低表达CRNDE人体肝癌细胞shRNA-CRNDE-HuH-7组。

1.3 RT-qPCR及Western blotting检测HL-7702细胞株、HuH-7细胞株 shRNA-CRNDE-HuH-细胞株中CRNDE、miR-33a-5p及CDK6 mRNA的表达情况 （1）细胞RNA提取和实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）：总RNA提取使用SYBR® Green Realtime PCR Master Mix反应系统。在PCR扩增反应结束后绘制溶解曲线，Ct值的获取采用MJ Opticon Monitor2.5分析软件进行计算，最后以GAPDH mRNA作为内参进行标准化核算，计算标本中各RNA相对表达量。（2）Western blotting分析：总蛋白提取，BCA法测定蛋白浓度，采用超敏型ECL化学发光显色试剂对其进行显色，使用UVP凝胶成像仪检测其蛋白灰度并成像。

1.4 对HL-7702细胞株、HuH-7细胞株及shRNACRNDE-HuH-7细胞株分别进行细胞增殖实验 CCK8（收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，酶联免疫吸附实验检测在450 nm处 24 h、48 h、72 h OD值）；细胞凋亡检测（收集细胞悬液，重悬于Binging Buffer，流式细胞仪检测，NovoExpressTM分析软件进行分析）；细胞侵袭测试（采用Transwell检测，通过细胞血清饥饿、接种消化、染色等步骤后，显微镜观察细胞数/视野）；细胞周期检测（收集细胞悬液，加入碘化丙啶，通过流式细胞技术测量细胞DNA含量，确定每个细胞周期中细胞的比例，NovoExpressTM分析软件进行分析）。通过上述方法评估在不同CRNDE表达情况下个别细胞株增殖、凋亡、侵袭能力及细胞周期的变化。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件包。计量资料以（）表示，组间比较采用t检验，相关性分析采用Spearman法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 稳定干扰CRNDE/低表达CRNDE人体肝癌细胞株构建检测 RT-qPCR 检测结果显示：shRNA-CRNDEHuH-7细胞株中CRNDE表达量（1.081±0.141）相比HuH-7细胞株（3.014±0.361）减少，组间差异有统计学意义（P＜0.05），见图1；Western blotting检测结果同以上结论。由此说明稳定干扰CRNDE/低表达CRNDE的shRNA-CRNDE-HuH-7人体肝癌细胞株的构建成功。

图1 RT-qPCR检测shRNA-CRNDE-HuH-7及HuH-7组CRNDE基因表达

2.2 HL-7702、shRNA-CRNDE-HuH-7及HuH-7三组细胞株中CRNDE、miR-33a-5p及CDK6的表达情况及相关性分析 RT-qPCR检测结果见表1；Western blotting检测结果同以上结论，见图2。当控制位点为CDK6时，HL-7702、shRNA-CRNDE-HuH-7及HuH-7三组细胞株中CRNDE表达量与其呈正相关（r=0.856，P＜0.05；）；当控制位点为miR-33a-5p时，三组细胞株中miR-33a-5p表达量与CDK6及CRNDE均呈负相关（r=-0.883，P＜0.05；r=-0.937，P＜0.05）。

表1 三组细胞株RT-qPCR 检测结果分析（）

表1 三组细胞株RT-qPCR 检测结果分析（）

组别CRNDEmiR-33a-5pCDK6 HL-77020.798±0.2133.014±0.3610.992±0.227 shRNA-CRNDE-HuH-71.081±0.1412.211±0.3431.981±0.276 HuH-73.014±0.3611.081±0.1413.021±0.303 t值2.7662.6982.031 P值0.0090.0090.027

图2 Western blotting检测三组细胞株CRNDE、miR-33a-5p及CDK6表达情况。

2.3 细胞增殖实验 采用CCK8法分别检测24 h、48 h、72 h OD值，绘制生长曲线，检测结果显示：HuH-7组细胞增殖能力显著，shRNA-CRNDE-HuH-7细胞增殖能力明显受到抑制，基本与HL-7702组细胞增殖曲线重合，见图3A；shRNA-CRNDE-HuH-7组24 h、48 h及72 h相对OD值与HL-7702组接近，但明显低于HuH-7组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3B。

图3 CCK8法检测三组细胞声势浩大细胞增殖能力（*P＜0.05）

2.4 Transwell测定法检测 shRNA-CRNDE-HuH-7细胞株迁移及侵袭能力，相比HuH-7组，shRNA-CRNDEHuH-7组细胞数明显减少，基本接近于HL-7702组细胞数，组间差异有统计学意义（P＜0.05），表明shRNACRNDE-HuH-7细胞株相比HuH-7细胞株迁移及侵袭能力明显下降，见图4。

图4 Transwell 测定法检测三组细胞株迁移及侵袭能力（*P＜0.05）

2.5 流式细胞仪检测 三组细胞株凋亡率分别为：HL-7702组33.19%±6.14%，shRNA-CRNDE-HuH-7组23.26%±4.86%，HuH-7组14.21%±3.92%。通过单因素方差分析统计，三组细胞株凋亡率差异有统计学意义（F=34.219，P＜0.001），表明三组间细胞计数差异不同或不完全相同，进一步组间两两比较q检验：三组细胞凋亡率在不同栏，表明P值均＜0.05，说明三组间细胞凋亡率两两比较差异均具有统计学意义。流式细胞仪检测三组细胞株，观察CRNDE低表达对肝癌细胞周期影响，结果显示，shRNA-CRNDE-HuH-7组G1期细胞比例增加，S期和G2期细胞比例减少，相比HuH-7组有明显差异（P＜0.05），见图5，说明CRNDE低表达抑制了细胞从G1期向S期和G2期的转变。

图5 流式细胞仪检测下调CRNDE对HuH-7细胞株细胞周期影响（*P＜0.05）

3 讨论

CRNDE最早在结直肠恶性肿瘤的研究中被发现存在差异表达，可参与染色质的表观遗传学调控［5］。随着研究的进展，GRNDE被发现可通过多种方式调控肿瘤的进展，尤其是通过调节组蛋白甲基化状态来影响相关基因的转录，影响肿瘤的发生与发展，起到了促进肿瘤增殖的作用［6］。为探究CRNDE对人原发性肝癌细胞的影响，作者对人原发性肝癌细胞（Huh-7细胞株）CRNDE的表达进行RT-qPCR检测，发现对比正常人体肝细胞（HL-7702细胞株），其表达量明显增加。同时，利用质粒转染技术，沉默CRNDE的表达，作者构建了CRNDE低表达的shRNA-CRNDE-HuH-7细胞株，发现其细胞的增殖、迁移及侵袭能力相比Huh-7细胞株明显下降。以上结果均表明CRNDE在人体肝癌中的高表达，促进了肿瘤的发生或发展。

为了进一步探究CRNDE促进肝癌增殖的机制及可能的下游靶基因，作者查阅相关文献，ZHANG C等［7］通过生物信息学预测发现miR-33a-5p可能是CRNDE及CDK6的潜在靶点。为了明确三者之间可能的关系，作者对其进行了相关性分析，结果显示，CRNDE的表达与CDK6呈正相关（P＜0.05），而miR-33a-5p与CDK6及CRNDE均存在显著的负相关性（P＜0.05），从侧面验证了CRNDE可介导miR-33a-5p/CDK6轴的假说。

CDK6属于细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclindependent kinases，CDKs）家族成员，是细胞周期调控机制的最核心成员之一［8］。近年来，相关研究发现，CDK6在恶性肿瘤中过表达并与多种恶性肿瘤的发生、发展相关，被称为细胞信号传导的“中心节点”。miRNA-33a是一种位于甾醇反应元件结合蛋白基因（sequences of the sterol-response-element-binding protein gene，SREBF2）内含子序列中的内含子miRNA，在肿瘤的发生、发展中发挥着重要的作用。WU等［9］发现，在乳腺癌组织中，miRNA-33a的下调与淋巴转移有关，其过表达可显著降低细胞增殖和侵袭，抑制肿瘤生长和肺转移。HAN等［10］也发现，miRNA-33a-5p的下调与HCC转移和生存不良显著相关，低表达的miRNA-33a-5p预示较低的5年生存率及早期复发率。本研究结果也支持上述观点，miRNA-33a-5p的表达在HL-7702、shRNACRNDE-HuH-7及HL-7702三组细胞株中逐渐下调，差异有统计学意义（P＜0.05），而在CCK8、Transwell及流式细胞仪等检测中，此三组细胞株的增殖、迁移、侵袭能力却逐步增强，说明miRNA-33a-5p的低表达与人原发性肝癌的进展及预后密切相关。

本研究中RT-qPCR及Western blotting结果显示，Huh-7细胞株中miR-33a-5p为低表达，而通过慢病毒转染CRNDE低表达的shRNA-CRNDE-HuH-7细胞株及HL-7702细胞株中miR-33a-5p的表达却显著上调（P＜0.05）。同时有研究［11］显示，在人结直肠癌细胞双荧光酶素实验中，CRNDE与miR-33a-5p能有效结合，抑制肿瘤增殖，使野生型CRNDE结合的荧光信号显著降低，这与本研究中通过质粒转染沉默Huh-7细胞株CRNDE的效果相同。为了进一步验证 miR-33a-5p与CDK6 间存在靶向关系。本研究通过RT-qPCR及Western blotting检测，结果显示Huh-7细胞株中CDK6的表达显著升高，而沉默CRNDE或过表达miR-33a-5p后的shRNA-CRNDE-HuH-7及HL-7702细胞株中CDK6的表达逐级下调，差异有统计学意义（P＜0.05），说明CRNDE是miRNA-33a-5p的上游基因，而CDK6处于CRNDE及miR-33a-5p的下游，且miR-33a-5p与CDK6间存在靶向关系。

综上所述，CRNDE能通过靶向调节作用抑制miR-33a-5p的表达，进而介导CDK6的升高，可能通过CRNDE/miRNA-33a-5p/CDK6轴促进肝癌增殖，其肿瘤生物学行为主要表现在影响肿瘤细胞周期的增殖调控上。作者预测CRNDE很可能成为人体肝细胞肝癌新的肿瘤标志物和分子生物治疗靶点。