基于生物信息学、网络拓扑策略探究针灸治疗胃溃疡的机制

王新宇,陈紫薇,刘江腾,黎蔚欣,彭慧,张新悦,杜琳

(北京中医药大学东直门医院,北京 100010)

胃溃疡是常见的消化系统疾病,慢性、周期性(饭后30 min)、节律性的上腹痛是其典型的临床表现。本病易反复发作,若未及时诊治,可导致胃出血、胃穿孔、幽门梗阻等并发症,甚至发生肠上皮化生,增加患者胃上皮组织恶变几率,严重影响患者生命健康及生活质量[1]。据文献报道,欧美地区消化道溃疡患病率为6%～15%,国内患病率为13.83%～19.72%,其中胃溃疡患病率占消化道溃疡的30%左右[2-6]。胃溃疡发病机制尚不明确,目前被广泛认同的有攻击因子说和防御因子失衡说。攻击因子增强或防御因子的破坏,均可导致黏膜的屏障功能损伤,继而发生溃疡[7]。现代医学对胃溃疡的治疗以缓解症状、促进溃疡愈合、防止并发症和预防复发为目的,具体可通过降低胃酸、保护胃黏膜、根除Hp 等来实现。虽然治疗效果较为显著,但仍然存在复发率高、不良反应大等问题[1]。

胃溃疡尚无明确的中医学病名。根据其典型症状,可将其归类于“胃痛”“痞满”等范畴。现代研究表明,中药、针灸等中医疗法对胃溃疡能起到很好的治疗作用。大量的基础、临床研究表明,针刺治疗消化道溃疡疗效确切。动物研究显示胃溃疡大鼠在电针治疗4 d后溃疡面可基本愈合[8];吕显威等[9]认为针灸可改善胃溃疡患者胃小凹及微血管形态,提高溃疡愈合质量;一项2017 年的系统评价结果显示,针刺和西药对消化道溃疡都能起到良好的效果,但针刺可以显著降低消化道溃疡的复发率[10]。针刺防治胃溃疡的疗效显著,但其机制尚未阐明。本文基于现代研究,试从生物信息学、网络拓扑策略[11]等方面,探究针刺治疗胃溃疡的主要作用机制。

1 资料与方法

1.1 文献检索

本文通过中国知网数据库、万方数据库和维普数据中文期刊数据库系统检索相关文献,检索时限为2001 年8 月—2021 年8 月。检索方式为主题词检索。检索词为“针刺”“针灸”“体针”“电针”“胃溃疡”“消化道疾病”。

1.2 纳入标准

以毫针或电针治疗胃溃疡的实验研究文献;随机对照的人类试验或动物实验,以及非随机的比较试验(前瞻性和回顾性);对照干预可采取安慰剂针灸、假针灸、不治疗、另一种积极治疗或药物治疗的形式;所选取的腧穴有具体定位及归经;感兴趣的结果。

1.3 排除标准

使用其他形式刺激的研究,包括无针穴位按压、艾灸、经皮电刺激;在干预前后评估结果的单组观察性研究;仅比较不同针灸形式的研究;以痛点、敏感点为进针点的研究。

1.4 文献筛选

两名研究人员使用预先设定的纳入和排除标准,独立检索数据库,选择合适的全文版本文献。研究人员的争议通过协商解决,若未达成共识,则由第三位研究员解决争议。

1.4.1 针刺后机体产生活性成分的蛋白靶点筛选

STITCH 是一个包含43 万种化学品的聚合数据库,链接到一个易于使用的资源,旨在促进蛋白质和化学品之间相互作用的研究。Swiss Target Prediction是一个基于二维和三维相似性度量和已知配体结合的web 服务器,可以准确预测生物活性分子靶标。从STITCH 和Swiss Target Prediction 数据库中获得与褪黑素、生长抑素(somatostatin, SS)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、P 物质(substance P,sp)、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)和神经降压素高结合亲和力(Posibility＞0.1)的靶标。合并上述2 个数据库的检索结果后去除重复值,得到活性化合物作用的靶点。

1.4.2 胃溃疡潜在治疗靶点的筛选

GeneCards 是人类基因的综合数据库,包含所有已注释和可预测的基因信息,整合了约150 个基因数据库资源,包括基因组、转录组、蛋白质组、遗传、临床和功能信息等。本研究以“gastric ulcer”为关键词检索了GeneCards 数据库,得到胃溃疡的相关靶点。

1.4.3 针刺抗胃溃疡相关靶点的筛选

将所得两组靶点用Venn 工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)进行分析。通过维恩图将针灸相关活性成分靶点与胃溃疡靶点之间的重叠量可视化,重叠部分即为针灸治疗胃溃疡的核心靶点。为明确针刺产生的活性成分与关键靶点之间的关系,运用Cytoscape3.8.2 软件绘制网络图,展示活性成分-靶点的关系。

1.4.4 蛋白质相互作用网络的构建

运用STRING11.5(https://string-db.org/cgi/input.pl)构建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction networks, PPI)网络。将针灸治疗胃溃疡的可能靶点上传到搜索工具(STRING11.5)中,选择人类作为物种检索相互作用的基因/蛋白质。为明确活性化合物与关键靶点之间的关系,将检索结果导入Cytoscape3.8.2 软件,运用Network Analyzer 插件进行网络拓扑属性分析,度值(Degree)越高,与其他节点的连线越多,说明该节点起到的作用越关键。

1.4.5 基因本体论与京都基因组百科全书的富集分析

富集分析采用基因本体(gene ontology, GO)富集分析和京都基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG),继而通过DAVID 数据库(https://david. ncifcrf.gov/home.jsp)绘制和可视化效应器靶标,为进一步的功能研究提供依据。

2 结果

通过检索数据库,共纳入36 篇动物试验及临床试验文献,筛选出22 个相关的活性物质,其中褪黑素、SS、5-HT、SP、PGE2、神经降压素出现频次最高,可能对胃溃疡有效[12-16]。

2.1 针刺治疗胃溃疡的靶点筛查

应用STITCH和Swiss Target Prediction数据库,得出与针刺后活性成分所作用的基因 60 个;从GeneCard 数据库中收集胃溃疡相关基因4 980 个。将两份原始文件中的人类基因名称标准化后匹配,绘制60 个针灸活性成分的相关靶点和4 980 个胃溃疡相关的靶点的韦恩图,得出了交集靶点(图1),即37 个潜在的胃溃疡治疗靶点。“针灸-活性成分-靶点-疾病”互作网络见图2,橘色菱形代表活性成分,粉色圆形代表60 个潜在靶点,红色八边形代表针刺治疗,黄色六边形代表胃溃疡,产生连接越多的节点相应的图形面积越大,在治疗中发挥的作用越明显,其中褪黑素、5-HT和PGE2在治疗过程中可能起到关键作用。

图1 交集靶点

图2 活性成分-潜在靶点网络图

2.2 PPI 网络的建立与分析

基于STRING 数据库构建PPI 网络,经过拓扑分析后,通过 Cytoscape 可视化,显示 88 个节点。“Degree”为网络中节点的连接数,可以反映节点之间的交互程度,Degree 值越大表示节点的重要性越大。POMC 最大(15),其次是SST(14)、TAC1(12)、SLC6A4(12)、HTR3A(11)和SLC6A3(10)。详见图3。Top20 核心靶点按程度排序如表1 所示,确定为针刺治疗胃溃疡的关键靶点。

2.3 GO 和KEGG 富集分析

GO 分析可以从3 个方面反映靶标功能,分别为细胞成分(cellular component, CC) 、 分子功能(molecular function, MF)和生物过程(biological process, BP)。GO 分析结果显示得到476 条生物学过程,其中396 条BP、25 条CC、55 条MF,分别取前20列表。

其中在BP 层面(图4),预测靶点主要参与环核苷酸第二信使偶联的 G 蛋白偶联受体信号通路(G protein-coupled receptor signaling pathway,coupled to cyclic nucleotide second messenger)、腺苷酸环化酶抑制G 蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路(adenylate cyclase-modulating G protein-coupled receptor signaling pathway)、平滑肌收缩(smooth muscle contraction)等生物过程具有显著意义;在CC层面,神经元胞体(neuronal cell body)、突触后膜整体成分(integral component of postsynaptic membrane)其所占比例较大;在MF 层面,与前列腺素受体活性(prostaglandin receptor activity)、二十醛类受体活性(icosanoid receptor activity)、神经肽受体活性(neuropeptide receptor activity)等关系密切。

图3 针刺治疗胃溃疡潜在靶点相互作用网络图

表1 与针刺治疗胃溃疡相关的靶点(按“Degree”排序)

图4 GO-BP 生物学功能分析

共富集得到KEGG 生物学过程7 条。图5 列出了潜在靶点的KEGG 富集结果。KEGG 信号通路涉及神经活性配体- 受体相互作用(neuroactive ligandreceptor interaction) 、 cAMP 信号通路(cAMP signaling pathway)、钙离子信号通路(calcium signaling pathway)、5-羟色胺能突触(serotonergic synapse)、生长激素合成分泌作用通路(growth hormone synthesis, secretion and action)、色氨酸代谢(tryptophan metabolism)和PPAR 信号通路(PPAR signaling pathway)。KEGG 通路分析结果显示,针刺能通过多种信号通路及代谢通路发挥治疗胃溃疡的作用。图6 总结了潜在靶点在cAMP 通路中的作用。

图5 KEGG 通路富集分析

图6 潜在靶点在cAMP 通路中的作用

3 讨论

本文基于生物信息学筛选潜在活性成分及对应靶点,预测针灸治疗胃溃疡、预防复发的关键作用靶点及信号通路。

“针刺-胃溃疡”共同靶点PPI 蛋白互作网络结果表明,针刺干预胃溃疡与37 个靶点相关,其中POMC、SST、TAC1、SLC6A4、HTR3A、SLC6A3、HTR1A 等蛋白交互作用相对较强。POMC 基因编码一种前蛋白,这种前蛋白经过加工可产生多种生物活性肽,如促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropin hormone, ACTH)、β-内啡肽(镇痛物质)和促黑激素等,这些活性肽在许多重要的信号通路中参与。同时POMC 的异常表达还与抑郁症、双相情感障碍等精神心理疾病密切相关[17]。动物实验表明,胃黏膜应激性损伤会伴随ACTH、β-内啡肽的升高,而药物干预可减轻粘膜损伤程度,同时使ACTH、β-内啡肽水平降低[18-19]。促黑激素则被证明可通过促进SS 表达对乙醇诱导的大鼠胃溃疡产生保护作用[20]。以上实验均体现了POMC 下游产物对胃溃疡的影响,但目前仍缺乏对POMC 于胃溃疡联系的直接探究。SST 的表达产生SS,在结合高亲和力G 蛋白偶联的SS 受体后,可抑制多种次级激素的释放;与胃肠道大多数的激素存在相互作用,从而抑制胃消化间期肌电复合波和胃排空、抑制回肠和胆囊收缩、抑制肠道内容物转运[21]。若SST 表达受到抑制,SS 分泌减少会使胃酸分泌增加、胃十二指肠黏膜的防御功能降低,从而增加了消化性溃疡的发生几率[22]。研究发现针刺可通过提高SS 水平来达到促进胃溃疡恢复的目的[14]。TAC1编码速激肽激素家族的4 种产物,SP、神经激肽A、神经肽K 和神经肽γ。这些神经递质可与神经受体和平滑肌细胞作用,起到血管扩张剂和促分泌剂的作用。研究发现SP 可以通过调节Akt/eNOS/NO 信号通路,避免炎症损伤血管内皮细胞[23]。大量研究结果表明,SP 可以显著促进伤口愈合,对慢性伤口也有较好的效果[24]。而在结构上,SP 与天然抗菌肽结构相似[25],可能对幽门螺旋杆菌感染起到一定的防御作用,但目前尚无实验研究其对幽门螺旋杆菌抗菌活性的强弱。与此同时,脑下行的和脊髓固有的SP 神经元释放阿片肽后,可以起到镇痛作用[26]。由此可见,TAC1 的表达可从病因、病理机制和症状3 个方面对胃溃疡起到治疗作用。SLC6A4、SLC6A3、HTR3A、HTR1A 均是5-HT 相关的基因。研究发现5-HT 信号系统在胃肠道功能性疾病中扮演了重要角色,该信号通路的异常可引发胃肠道动力及分泌功能异常和内脏高敏感性[27]。此外,这些基因的异常表达还常见于精神、心理疾病。总的来说,这些基因联系紧密,在针刺促进胃溃疡修复的进程中相互影响,但目前的研究多着眼于单个基因某个下游产物对胃溃疡的作用机制,未针对全部下游产物逐个挖掘,且缺乏胃溃疡修复过程中多基因协作机制的研究。

GO 分析结果表明,针刺治疗胃溃疡的作用机制是多靶点、多层次的,由多种生物学过程共同参与而成,KEGG 通路分析结果将靶点富集的生物过程展示出来。首先,BP 层面涉及G 蛋白偶联受体信号通路、平滑肌收缩,这与Ca2﹢信号通路密切相关。兴奋-收缩偶联时,膜去极化诱导电压门控Ca2﹢通道打开,胞内Ca2﹢浓度增加,激活RyR 开放,触发内质网局部释放Ca2﹢,导致肌肉收缩[28]。SERCA 是存在于肌浆网和内质网的膜转运蛋白,主要功能是将胞浆内的Ca2﹢转运到肌浆网和内质网中,维持细胞内的Ca2﹢稳态[29]。针刺可以通过促进GPCR 的表达,增加PLN 磷酸化,减少PLN 对SERCA 的抑制,促进内质网摄取Ca2﹢,胞质中Ca2﹢浓度下降,促进肌肉舒张;内质网Ca2﹢储存量增加,可进一步激活RyR 开放,促进肌肉收缩。PKA 是抗抑郁药物的靶点之一,抗抑郁药物可以通过增强大脑特定部位PKA 的活力来达到治疗目的[30]。如图6,GPCR 载体在GPCR-cAMP-PKA 信号通路中也起到了作用,ATCH 和SST均可以作用于GPCR,从而起到上调PKA 表达的作用,现代研究结果提示电针可以通过该通路起到抗抑郁的作用[31]。在GO-CC 层面涉及神经元胞体、突触后膜整体成分,其中KEGG 结果提示,5-HT 能突触起到重要作用。针刺产生的活性物质5-HT 可以通过激活胶质细胞上的5-HT2A和SERT 促进内质网释放Ca2﹢、促进胞外Ca2﹢内流,提高胞内Ca2﹢水平,从而促进平滑肌收缩。现代研究发现,5-HT 收缩胃底平滑肌与PKC 有关,这与KEGG 富集结果也是一致的[32]。此外5-HT 还可以激活5-HT4,6,7通路,通过AC5 上调cAMP 通路,起到调整抑郁状态的作用。

综上,本研究预测针灸可能通过POMC、SST、TAC1、SLC6A4、HTR3A 等关键靶点来调节cAMP 信号通路、钙离子信号通路、5-HT 能突触等,从而促进平滑肌收缩、保护血管内皮、防御幽门螺旋杆菌、镇痛、调节抑郁状态,从缓解症状、促进愈合、去除诱发因素等不同层面达到治疗胃溃疡的目的。大量现代研究发现,不良情绪与消化道疾病关系密切[33]。通过本次研究可推测,针刺治疗伴发情绪障碍的胃溃疡可取得较好的疗效,而改善患者情绪也可以起到预防胃溃疡等消化道疾病复发的作用。

本研究只纳入了针刺治疗后人体产生的6 种具有代表性的活性物质,其他活性物质仍需进一步数据挖掘和实验验证,未对针灸处方、治疗时长和频率等针灸治疗的重要参数进行分析,并缺乏对研究结果的验证。

中医学认为,人体自身是一个有机整体。针刺可以通过穴位刺激,多靶点、多层次地调控人体网络,从而起到治疗作用。笔者基于文献研究,借助生物信息学和网络拓扑学方法,研究针刺治疗胃溃疡的生物学机制,为针刺治疗胃溃疡的基础实验研究提供了理论依据。