矢志方激活Sirt1-Foxo1 通路调控内质网应激相关蛋白改善高尿酸血症小鼠肾损伤*

杨枫，王传旭，吴志远，张栩铭，高建东

（上海中医药大学附属曙光医院，上海中医药大学中医肾病研究所，上海中医药大学肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海市中医临床重点实验室，上海 201203）

高尿酸血症（HUA）是由于嘌呤代谢紊乱导致血清尿酸（UA）升高的代谢综合征，对人体心脑血管、关节、肾脏等器官造成损害[1-2]。随着人们生活水平的提高，HUA 的发病率逐年升高，UA 长期堆积在肾脏会引起肾小管间质纤维化，从而引发UA 性肾病[3]。临床一线降UA 药物如黄嘌呤氧化酶抑制剂非布司他、别嘌呤醇，促进UA 排泄药物苯溴马隆等，长期服用存在一定副作用、血清UA 控制不佳等问题[4]。

沉默信息调节因子1（Sirt1）/叉头转录因子1（Foxo1）信号通路与肾脏病理生理发展密切相关。Sirt1 在肾脏中广泛存在，激活Sirt1 可抑制Foxo1 乙酰化水平，对肾脏起保护作用。Sirt1 表达增加可减轻草酸钙晶体诱导的肾损伤[5]，缓解脂多糖所导致的氧化应激引起的肾损伤[6]。内质网应激（ERS）是维持细胞内稳态的重要细胞器，肾小管上皮细胞损伤是一种病理和生理的改变，在HUA 早期和进展期发挥关键作用[7]。在正常情况下，适度ERS 能保护细胞活性，如果长时间高UA 刺激则会超出内质网代偿能力，造成细胞损伤[8]。

矢志方是上海中医药大学附属曙光医院肾病科临床经验方。临床疗效较好，能显著降低痰浊瘀阻型HUA 的UA 水平[9]。前期大量基础实验研究表明，矢志方能降低HUA 小鼠和HUA 大鼠UA 水平、改善HUA 小鼠和HUA 大鼠肾功能[10-13]。基于本课题组前期研究基础，本实验通过建立HUA 小鼠模型，观察基于Sirt1-Foxo1 通路矢志方对HUA 小鼠肾组织和高UA 诱导HK2 细胞ERS 相关蛋白表达的影响，以期为矢志方的临床应用提供更多实验依据。

1 实验材料

1.1 动物 选取32 只8 周龄SPF 级雄性BALB/c小鼠，体质量12～22 g，购自上海斯莱克实验动物，动物许可证号SCXK（沪）2017-0005，伦理证号PZSHUTCM211227011。在上海中医药大学实验动物中心饲养，温度25 ℃左右，湿度45%左右，12 h 光照，普通饮食饮水喂养。

1.2 实验细胞 人肾小管上皮细胞HK2，购自中国科学院细胞库。

1.3 实验药物 动物用药：矢志方（车前子30 g，芥子15 g，王不留行15 g，冬葵子15 g），饮片购自上海中医药大学附属曙光医院，并委托国家中药制药工程技术研究中心制备成中药复方颗粒剂（1 g 颗粒相当于原方20 g），用蒸馏水配制成70 mg/mL 药液。非布司他片，40 mg/片，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号H20130081，用蒸馏水配制成0.75 mg/mL药液。

矢志方冻干粉制作流程：称取炒王不留行、炒芥子各3.6 kg，炒车前子7.2 kg，冬葵子3.6 kg，混合均匀，打粉，粉碎后加入药材10 倍体积纯净水包煎，先煮1 h，过滤，再加8 倍水浸泡1 h，加热回流提取2 次，每次1 h。最终得到冻干粉0.9 kg。

细胞用药矢志方溶液配制：50 mL 试管中加入10 mL 含10%胎牛血清（FBS）、1%P/S 的F12/DMEM完全培养基，称取矢志方干粉600 mg，加入到试管中，细胞裂解仪30%功率5 min 促进干粉溶解，矢志方溶液终浓度为60 mg/mL。

UA 配置：称取100 mg UA 加入10 mL 双蒸水，震荡混匀充分溶解后滤过使用，UA 溶液终浓度为10 mg/mL。

1.4 主要试剂与仪器 氧嗪酸钾、羧甲基纤维素钠（CMCC-Na），上海麦克林生化科技有限公司，货号分别为P831461、C10097951；UA，美国Sigma 公司，货号u2875-5 g；Sirt1，美国CST 公司（货号8469s）；内质网跨膜蛋白肌醇酶1α（IRE1α），美国CST 公司（货号3294s）、武汉Abclonal 公司（货号A17940）；天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）12，美国Signalway Antibody 公司（货号48277）、武汉Abclonal 公司（货号A22864）；增强子结合蛋白同源蛋白（Chop），美国CST 公司（货号2895s）、武汉Abclonal 公司（货号A113466）；Foxo1，美国CST 公司（货号2880s）；GAPDH，美国Proteintech 公司（货号60004-I-Ig）；α-Tubulin，上海碧云天公司，货号AF2827；HRP 标记山羊抗小鼠IgG、HRP 标记山羊抗兔IgG，上海碧云天公司，货号分别为A0216、A0208；PVDF 膜，美国Millipore 公司，货号IPVH00005。离心机，美国Beckman 公司，型号Avanti J-E；凝胶成像系统，上海天能生命科学有限公司，型号Tanon-5200；生物组织冷冻包埋机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-BM；烘片机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-H；酶标仪，美国BioTek 公司，型号Synergy 2；组织匀浆器，上海净信科技有限公司，型号JY-24；显微镜，日本奥林巴斯公司，型号CX33。

2 实验方法

2.1 动物分组、造模与给药 造模及给药方法参考文献[8]，32 只小鼠适应性饲养1 周后，随机分为正常组、模型组、非布司他组和矢志方组，每组8 只。正常组用同等体积生理盐水灌胃，其余各组采用250 mg/kg 氧嗪酸钾溶液灌胃建立HUA 小鼠模型。4 h 后给予药物干预即非布司他组灌胃非布司他药液6 mg/kg，矢志方组灌胃矢志方药液562.5 mg/kg，参考《中药药理实验方法学》的人与小鼠药物换算方式和本课题组前期实验，每只小鼠每10 g 灌胃0.2 mL，每日1 次，正常组和模型组予等体积生理盐水灌胃，造模与给药同时进行，连续2 周。

2.2 细胞培养与造模方法 将HK2 细胞用含10%FBS 和1%双抗的DMEM/F12 培养基于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，细胞密度为90%时进行细胞传代，取对数生长期细胞进行细胞铺板，细胞贴壁后用含0.5%FBS 的DMEM/F12 培养基饥饿处理12 h，再进行相应干预，干预24 h 后处理细胞进行后续实验。将细胞分为正常组，模型组（200 μg/mL UA），中药组（200 μg/mL UA＋300 μg/mL 失志方）。

2.3 取材 第14 日给药结束后，0.8%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，摘取双侧肾脏分别用于病理观察、蛋白免疫印迹法（Western blot）实验和免疫荧光染色。

2.4 病理观察 小鼠肾脏组织经4%多聚甲醛组织固定液固定24 h，梯度脱水、浸蜡、包埋，4 μm 厚度切片，37 ℃烤片12 h，然后进行苏木精-伊红（HE）染色、Masson 染色，中性树脂封片，显微镜下观察小鼠肾脏组织病理形态。

2.5 Western blot 检测 取20 mg 小鼠肾组织，加入RIPA 裂解液200 μL，匀浆机65 Hz 匀浆1 min，4 ℃、12 000 rpm 离心15 min，离心半径6 cm。BCA 法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液和生理盐水配制成浓度为40 μg/μL 的等量蛋白样品。上样，120 V 电泳1 h，300 mA、1 h 30 min 转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入IRE1α 一抗（1∶1 000）、Sirt1一抗（1∶1 000）、Foxo1 一抗（1∶1 000）、Caspase 12 一抗（1∶1 000）、Chop 一抗（1∶1 000）、α-Tubulin 一抗（1∶1 000）、GAPDH 一抗（1∶5 000），4 ℃孵育过夜；PBST 洗膜3 次，加入HRP 标记的山羊抗小鼠IgG（1∶1 000）、山羊抗兔IgG（1∶1 000），室温孵育1 h；PBST 洗膜3 次，ECL 化学发光法显影，凝胶成像系统拍摄。以GAPDH 和α-Tubulin 为内参，计算目的蛋白相对表达量。

2.6 免疫荧光染色 细胞经爬片、干预结束后，4%多聚甲醛室温固定爬片细胞30 min，室温通透细胞20 min，加入1%BSA 室温封闭60 min，加入稀释的IRE1α 一抗（1∶200）、Sirt1 一抗（1∶1 000）、Foxo1 一抗（1∶1 000）、Caspase 12 一抗（1∶400）、Chop 一抗（1∶400），4 ℃孵育过夜；加入荧光二抗（1∶500），避光孵育1 h，加入DAPI 染细胞核5 min，甘油封片，荧光显微镜下观察。

2.7 免疫组化染色 肾组织石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，3%牛血清白蛋白溶液（BSA）室温封闭30min，加入IRE1α 一抗（1∶100）、Sirt1 一抗（1∶100）、Foxo1一抗（1∶100）、Caspase12 一抗（1∶100）、Chop 一抗（1∶100）。4 ℃孵育过夜，加二抗室温孵育50 min，二氨基联苯胺（DAB）显色，中性树脂封片，光镜下观察，以棕黄色颗粒为阳性表达。

3 统计学方法

采用SPSS22.0 统计软件和Image J 1.8 软件进行分析。实验数据以均数±标准差（±s）表示，多重比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05 表示有统计学意义。

4 结果

4.1 矢志方对模型小鼠肾组织病理形态的影响 与正常组比较，模型组小鼠肾组织结构紊乱，肾小管管腔扩张、管壁变薄，肾间质炎性细胞浸润，大量蓝色胶原纤维沉积；与模型组比较，矢志方组和非布司他组小鼠肾小管管腔扩张、炎性细胞浸润、蓝色胶原纤维集聚程度减少。见图1。

图1 各组小鼠肾组织形态（×400）Fig.1 Pathological changes of mouse kidney tissue in each group（×400）

4.2 矢志方对高UA 小鼠肾组织和高UA 诱导HK2 细胞Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 蛋白表达的影响 Western blot 结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肾组织IRE1α、Foxo1、Caspase12、Chop 蛋白表达显著升高（P<0.01 或P<0.001），Sirt1蛋白表达显著降低（P<0.001）；与模型组比较，非布司他组小鼠肾组织和矢志方组小鼠肾组织IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 蛋白表达显著降低（P<0.001），Sirt1 蛋白表达显著升高（P<0.001）。细胞Western blot 结果与HUA 小鼠肾组织Western blot结果趋势一致，见图2，图3。

图2 各组HK2 细胞Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 蛋白表达情况（±s）Fig.2 Protein expressions of Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop in HK2 cells of each group（±s）

图3 各组小鼠肾组织Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 蛋白表达情况（±s）Fig.3 Protein expressions of Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop in mouse kidney tissue of each group（±s）

4.3 矢志方对高UA 小鼠小鼠肾组织Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 表达的影响 免疫组化染色结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肾组织IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 表达显著升高（P<0.01 或P<0.001），Sirt1 表达显著降低（P<0.001）；与模型组比较，非布司他组和矢志方组小鼠肾组织IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 表达显著降低（P<0.05，P<0.01 或P<0.001），Sirt1 表达显著升高（P<0.05）。见图4。

图4 各组小鼠肾组织Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase12、Chop 阳性表达情况（免疫组化染色，×400）Fig.4 Postive expressions of Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase12、Chop in mouse kidney tissue of each group（Immunohistochemical staining，×400）

4.4 矢志方对高UA 诱导HK2 细胞Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase12、Chop 表达的影响 免疫荧光染色结果显示，与正常组比较，模型组细胞IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 表达显著升高，Sirt1 表达显著降低；与模型组比较，矢志方组细胞IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 表达显著降低，Sirt1 表达显著升高。见图5-9。

图5 各组HK2 细胞Sirt1 阳性表达（免疫荧光染色，×400）Fig.5 Postive expressions of Sirt1 in HK2 cells of each group（Immunofluorescence staining，×400）

图6 各组HK2 细胞IRE1α 阳性表达（免疫荧光染色，×400）Fig.6 Postive expressions of IRE1α in HK2 cells of each group（Immunofluorescence staining，×400）

图7 各组HK2 细胞Foxo1 阳性表达（免疫荧光染色，×400）Fig.7 Postive expressions of Foxo1 in HK2 cells of each group（Immunofluorescence staining，×400）

图8 各组HK2 细胞Caspase 12 阳性表达（免疫荧光染色，×400）Fig.8 Postive expressions of Caspase 12 in HK2 cells of each group（Immunofluorescence staining，×400）

图9 各组HK2 细胞Chop 阳性表达（免疫荧光染色，×400）Fig.9 Postive expressions of Chop in HK2 cells of each group（Immunofluorescence staining，×400）

5 讨论

HUA 引起肾损伤的机制十分复杂，主要包括氧化应激、内皮功能障碍、肾纤维化和炎症[3]。本课题组前期研究发现矢志方临床疗效显著，前期基础实验研究表明，矢志方能抑制白细胞介素-1β（IL-1β）IL-1β 表达、促进有机阴离子转运蛋白1/3（OAT1/3）、肝细胞核因子1α/4α（HNF1α/4α）表达减轻HUA 小鼠肾脏损伤。ERS 与肾损伤密切相关[14-15]，本研究中发现ERS 的调节因子Sirt1 在HUA 小鼠肾组织中显著下调，给予矢志方干预后能上调Sirt1 表达水平、矢志方还能抑制ERS、改善肾损伤和间质纤维化。因此，Sirt1 和ERS 可能是HUA 诱导的肾间质纤维化的潜在治疗靶点。

内质网是一个表型和功能多样的传感平台，与调节蛋白沉积、脂质代谢、糖异生和钙信号传导等多种细胞功能密切相关，是维持和恢复代谢健康的重要组成部分。内质网稳态的紊乱通常被称为ERS，ERS 是一种功能失衡状态，通过激活内质网激酶（PERK）/真核起始因子2α（eIF2α）途径中C/EBP同源蛋白（Chop）、IRE1α-凋亡信号调节激酶1（ASK1）-c-Jun N 端激酶（JNK）通路、IRE1α-X 盒结合蛋白1（XBP1）-Chop 通路、激活Caspase 12 通路调控细胞凋亡。轻度ERS 时，内质网可通过激活未折叠蛋白反应途径（UPR）启动自噬以恢复内质网稳态，促使细胞存活；当ERS 刺激过强且持续存在时，会过度诱导自噬或激活凋亡途径使细胞死亡。

UPR 包括重建内质网稳态的途径以及触发凋亡的途径，即转录因子依赖和Caspase 12 依赖的途径[16]。在转录因子依赖的途径中，葡萄糖调节蛋白78（GRP78）在ERS 激活时与IRE1 解离，IRE1α 的管腔结构域感知未折叠蛋白的积累，从而导致其二聚化和自身磷酸化。这激活了其胞质内核糖核酸酶活性，启动了两个独立的事件来恢复蛋白沉积。一个是通过调节的IRE1 依赖性衰变（RIDD）降解mRNAs，通过IRE1α 切割并去稳定内质网定位的mRNAs，从而减少新合成的蛋白质进入内质网腔所产生的折叠负担。另一种是X 盒结合蛋白-1（XB P1）mRNA 的非规范特异性剪接[17]，XBP1s 还通过丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）信号的磷酸化在蛋白质水平上受到调节[18]。UPR 的IRE1α-XBP1 途径是维持代谢稳态的关键因素[19-22]。在Caspase 12 依赖性途径中，钙离子（Ca2+）从细胞内储存到胞质溶胶，导致钙蛋白酶转移到内质网，使Caspase 12 活化，然后通过Caspase 9 的激活，诱导Caspase 3 依赖的凋亡途径，以促进细胞凋亡[23]。另外，IRE1 通过上调Chop 转录因子，一方面，活化的Chop 上调B 淋巴细胞瘤-2 基因（Bcl-2）家族促凋亡蛋白Bax 发挥促凋亡作用；另一方面，Chop 促进TRAIL 受体2（DR5）的转录，活化Caspase 8 依赖的外源途径的细胞凋亡。表明Chop 在靶向ERS 激诱导的细胞凋亡中发挥了关键作用[24]。本研究发现矢志方能在体内体外下调IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 蛋白表达水平，表明矢志方能通过抑制ERS 缓解肾脏损伤。

Sirt1 是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的组蛋白去乙酰化酶，参与代谢、衰老、细胞存活、自噬和糖尿病的调节。Sirt1 通过去乙酰化激活各种蛋白质和转录因子。Foxo1 是其中一个被Sirt1 去乙酰化的转录因子，参与细胞的氧化应激抵抗、细胞凋亡、细胞周期阻滞、胰岛素信号转导和代谢等[25]。有研究报道，Sirt1 存在于细胞核中，但它可以穿梭到细胞质中，作为组蛋白的去乙酰化酶，以及许多非组蛋白靶点[26]。受Sirt11 调控的Foxo 转录因子的乙酰化状态可以选择性地将Foxos 定向到特定的靶点，是代谢和应激反应的另一个调控途径[27]。进一步的研究报道，Foxo1 被Sirt1 介导的赖氨酸242、245 和262 的脱乙酰化激活[28]。因为到目前为止已经证明Sirt1 通过调节Foxos 的表达来防止ROS 产生和氧化应激，但是也已经提出增加的氧化应激可以反过来控制Sirt1 活性，但是Foxo 参与该活性的可能性还不清楚[29]。Sirt1 在调节ERS 方面发挥了重要作用，它可通过调控内质网相关分子PERK、GRP78 缓解ERS 减轻阿霉素引起的心脏毒性[30]。本研究结果表明Sirt1 在受高UA 刺激后表达降低，而矢志方能显著激活Sirt1 水平，改善肾脏损伤，并且下调ERS 相关蛋白，说明Sirt1 可通过调控ERS 减轻HUA 所导致的肾损伤。

综上所述，矢志方可减轻HUA 小鼠肾脏损伤，其机制与激活Sirt1-Foxo1 通路抑制ERS 相关蛋白及下游Chop、Caspase 12 蛋白表达有关。然而，HUA引发ERS，以及进一步导致肾损伤并没有完全了解，还有待进一步研究。