油菜DNA 快速高通量提取方法改良及应用

朱先飞，韩仁长，黄冠，丁龙，余洪根，陈世春，方先勇，夏金凤，刘金师

（安徽国豪农业科技有限公司，安徽合肥 230000）

油菜是世界四大油料作物之一，也是我国第一大油料作物，作为食用植物油和植物蛋白的主要来源，油菜在农产品中占有重要地位。随着生物育种技术的发展，分子标记辅助育种已经成为油菜育种的重要手段，油菜品种的真实性检测和杂交种纯度的DNA 检测已经开展得越来越多[1-3]，而油菜DNA 的提取是以上分子生物学操作的基础。一般实验室提取DNA 的方法有磁珠法[4]、CTAB 法[5]、SDS 法[6]等，这些方法提取的DNA 浓度高、完整性好，但操作步骤繁琐复杂、耗时长，每次提取大致需要3～4 h，提取量大时耗费时间更久。

前人对DNA 快速提取方法已经进行了许多研究。郭景伦、易红梅等[7-8]利用碱裂解法对玉米的DNA 进行快速提取，并成功应用于PCR 反应；孙林静等[9]利用碱裂解法对水稻的DNA 进行快速提取，并成功应用于PCR 反应。此外，该方法在花生[10]、大豆[11]等油料作物中都有研究。油菜DNA 提取已经有了不少研究[12-13]，该文在前人研究的基础上对油菜的碱煮法DNA 提取方法进行了改良，无需采用研磨，使用普通PCR 板即可，更加简化，成本更低，同时与磁珠法提取效果进行比较，简单的SSR 分子标记操作上并无明显差异。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料。供试材料为安徽国豪农业科技有限公司科研基地所选取的油菜组织。

1.1.2 主要试剂与仪器。固体NaOH 购于国药集团化学试剂有限公司；1.5 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH=8.8）以及琼脂糖凝胶电泳所用的核酸染色剂（GoldViewⅠ型核酸染色剂）购于索莱宝生物科技有限公司；50×TBE 缓冲液；DNA Marker 购于索莱宝生物科技有限公司；2×TaqMaster Mix for PAGE 购自南京诺维赞；PCR 扩增仪型号为T100，购自美国伯乐公司；高速离心机为赛默飞Micro 17R；电泳仪型号为DYY-8C，购自北京市六一仪器厂；凝胶成像系统型号为Azure Biosystems C200；磁珠法提取试剂盒购自天根生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取。碱煮法：分别剪取油菜的根、茎秆或叶片约100 mg 放入96 孔板（200 μL）中，每孔加入DNA 提取液0.2 mol/L NaOH 40 μL，100℃水浴锅中水浴1 min 后取出，加入提取液0.17 mol/L Tris-HCl 60 μL，100℃水浴锅中水浴2 min 后取出，提取后的DNA 放4℃冰箱保存留用或直接吸取1 μL 的上清液用于PCR 反应。

磁珠法：取新鲜植物组织或粉状干燥组织50～200 mg，用液氮在研钵中研磨充分，加入1 mL 的Lysis Buffer（65℃预热）研磨均匀，然后转移到1.5 mL 的EP 管，混合均匀。将EP 管置于恒温水箱中65℃温浴30～60 min。期间不时摇动，温浴结束后，12 000 r/min 离心10 min。取200 μL上清液于新的1.5 mL EP 管中，加入20 μL RNA 酶混匀，5 min 后加入20 μL bead、200 μL 异丙醇，颠倒混匀静置5 min 后，将EP 管置于磁力架上磁分离，吸弃上清液。移去磁力架，加入800 μL Wash Buffer，振荡混匀静置5 min 后，将EP 管置于磁力架上磁分离，吸弃上清液。若有团状或丝状物可增加振荡时间及力度，重复该步骤1 次。移去磁力架，加入100 μL Elution Buffer，移液枪缓慢吹打混匀1～2 min，将离心管在磁力架上静置0.5 min，小心吸走上清液放入新离心管即为提取的DNA，存放于2℃～8℃，长期存放需置于-20℃（洗脱液在65℃～70℃中预热后洗脱效果更好，减小洗脱体积或多次洗脱可增大DNA 浓度）。

1.2.2 PCR 扩增。PCR 反应体系：采用15 μL 反应体系，其中DNA 模板1 μL，正向引物和反向引物各1 μL，2×Mix 7.5 μL，ddH2O 4.5 μL。PCR 反应引物见表1。

表1 PCR 反应所用引物名称和序列

PCR 反应程序：将PCR 反应所需的成分配置完后，在PCR 仪上于94℃预加热5 min，使模板DNA 充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，94℃保持30 s 使模板变性，然后将温度降到55℃，保持30 s，使引物与模板充分退火；在72℃保持30 s，使引物在模板上延伸，合成DNA。重复循环30 次，使扩增的DNA 片段大量累积。最后，在72℃保持5 min，使产物延伸完整，在4℃保存。

电泳检测：PCR 产物凝胶电泳检测以3 μL DNA 2000 Marker 作为标记，然后吸取8 μL DNA 溶液点入琼脂糖凝胶的胶孔中，电泳25 min（U=120 V），将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中拍照分析。

2 结果与分析

2.1 高通量快速提取法与磁珠法提取DNA 效果对比

高通量快速提取与磁珠法提取的DNA 用同样的一组引物，采用相同的PCR 运行程序，点样3 μL，电泳条件完全相同。凝胶成像系统结果显示，两种方法提取的DNA 效果并无明显差异，磁珠法提取的扩增效果浓度稍大（图1～2）。

图1 碱煮法高通量提取的DNA 扩增效果

图2 磁珠法高通量提取的DNA 扩增效果

2.2 油菜不同生长时期的DNA 提取效果

凝胶成像系统结果显示，油菜不同生长时期提取的DNA 扩增效果无明显差异，条带亮度与Marker 接近，均清晰可读（图3）。

图3 不同时期叶片碱煮法高通量提取的DNA 扩增效果

2.3 油菜不同部位的DNA 提取效果

凝胶成像系统结果显示，油菜植株不同部位提取的DNA 的扩增效果无明显差异，条带亮度与Marker 接近，均清晰可读（图4）。

图4 不同部位碱煮法高通量提取的DNA 扩增效果

3 讨论与结论

与传统提取DNA 的方法相比，该试验方法有诸多优点：一是不需要复杂多样的有毒试剂，如三氯甲烷等；二是使用的仪器设备少，避免DNA 提取过程中的污染；三是操作简单、提取时间短，96 孔PCR 板提取完毕只需要20～30 min，大大提高了油菜群体基因型筛选和分子标记辅助选择的效率。

俎峰等[13]改良了传统油菜DNA 提取方法，通过油菜杂交种深孔板内发芽，简化碱裂解法提取DNA 步骤，配合高通量研磨器的使用，提供了快速高通量低成本获取油菜杂交种子叶片DNA 样品的集约化方案，提高了DNA 获取效率，有利于利用分子标记对杂交油菜种子进行纯度鉴定。该文在以上研究的基础上，进一步优化试验步骤，找到一种快速、高通量、低成本提取油菜DNA 的方法，并将其应用到品种筛选及分子标记辅助选择中。

与以磁珠法为代表的传统提取法相比较，该研究提供的碱煮法快速高通量提取的DNA 扩增效果上并没有明显差异，对于简单的SSR 引物扩增基本没有影响，因此对于简单的基因分型和分子标记辅助育种等试验来说，碱煮法可以大大提高工作效率。

同时，通过对油菜不同时期不同部位提取的DNA 进行扩增，凝胶成像显示并无明显差异，因此碱煮法提取DNA 可以在油菜不同时期和不同部位应用，进一步提高了碱煮法的使用效率。