高品质低聚木糖对小鼠肠道菌群及免疫功能影响的研究

张庆明，徐云燕，贾 佳，潘海娟，张 平

东部战区总医院 药剂科,南京 210002

低聚木糖（xylooligosaccharides，XOS）是由2～7个木糖分子通过β-1，4-糖苷键连接而成的一种低聚糖[1],对酸热稳定性良好，能被肠道中的双歧杆菌和乳酸菌等益生菌利用，而难以被有害微生物如葡萄球菌、肠球菌和梭状芽孢杆菌等利用[2-4]。双歧杆菌等益生菌代谢低聚木糖会产生乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）。这些短链脂肪酸不仅能为肠黏膜细胞提供能量，促进细胞的生长代谢，还能降低肠道内的pH 值，抑制有害菌的生长[5]；此外，SCFAs 还与促进钙的吸收和脂质代谢、防治心血管疾病和减少结肠癌的风险等多种生理功能密切相关[6]。

目前主要是通过微生物来源的木聚糖酶水解秸秆、玉米芯等农业废弃物中提取木聚糖来生产低聚木糖[7]，但经木聚糖酶水解制备的低聚木糖是一种由木糖到木七糖组成的复杂混合物。研究表明，木二糖和木三糖比其他木寡糖对益生菌具有更高的增殖活性[8]，但由于利用分离纯化手段从性质相近的低聚木糖混合物中获得高纯度的木二糖、木三糖步骤多、难度大，因此目前多数研究仍集中在低聚木糖混合物对益生菌的增殖作用及其机制方面，缺乏高木二糖、木三糖含量的低聚木糖（HXOS）与普通低聚木糖产品（RXOS）作用的对比研究。因此，本实验首先通过体外培养研究HXOS 对几种益生菌生长的影响，并进一步研究其对小鼠内肠道菌群数量、SCFAs 含量及免疫功能的影响，为高品质低聚木糖的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF 级的BALB/C 雄性小鼠60 只，6～8 周龄，18～22 g，由浙江医学院提供[生产证许可号：SCXK（浙）2019-0002]，饲养室温度20℃～25℃，相对湿度40%～60%。普通低聚木糖产品购自山东龙力生物科技有限公司，纯度95%，其中木二糖+木三糖+木四糖含量为65%。高品质低聚木糖由南京工业大学提供，纯度96%，其中木二糖+木三糖含量为98%。双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、肠杆菌和产气荚膜菌分别采用BBL 培养基、MRS 培养基、叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂培养基、EMB 培养基和TSC 培养基，上述培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。长双歧杆菌（Bifidobacterium longum 1.218 6）、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis 1.219 0）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum 1.185 6）和德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii 1.875 0）均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。该方案经江苏省药物研究所动物管理与使用委员会批准（批准号：LL-20200507-01）。本文的实验场所为东部战区总医院药剂科制剂室的实验室。

1.2 不同品质的低聚木糖对双歧杆菌和乳杆菌生长的影响

在BBL 培养基或MRS 培养基中分别加入0、0.5%和1%的普通低聚木糖和高品质低聚木糖，以不添加低聚木糖的作为空白对照组，每组三个重复，121℃灭菌后分别加入长双歧杆菌和青春双歧杆菌或植物乳杆菌和德氏乳杆菌，37℃厌氧培养48 h后，利用平板计数法测活菌数[9]。

1.3 受试小鼠分组及饲喂剂量

将小鼠随机分成低聚木糖（普通级和高品质）低剂量组和高剂量组及空白对照组，每组12 只。由于低聚木糖的人体推荐剂量（60 kg）为0.7～1.4 g·（kg·bw）-1，因此选取1.2 g·（kg·bw）-1作为参考剂量，设计其5 倍和10 倍添加量作为低聚木糖的低剂量组[100 mg·（kg·bw）-1]和高剂量组[200 mg·（kg·bw）-1]。以0.2 mL 每日灌胃1 次，连续14 d，空白对照组灌胃等量蒸馏水。

1.4 小鼠肠道菌群的计数

在给予低聚木糖前和14 d 后，无菌采集小鼠粪便，称重后（约0.5 g）加入4.5 mL 无菌生理盐水中，充分振荡混匀后静置5 min，采取10 倍梯度稀释上清液至10-6。将稀释液分别接种在BBL 培养基、MRS培养基、叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂培养基、EMB培养基和SMAC 培养基上。双歧杆菌和乳杆菌在37℃下培养48 h，而肠球菌、肠杆菌和产气荚膜菌37℃下培养24 h。每个稀释度和每种培养基分别设置三个重复。培养结束后进行菌落平板计数，计算每克粪便中各菌落菌数并取对数即lg（CFU·g-1），进行统计分析[10]。以粪便中双歧杆菌与肠杆菌的菌数比值（B/E）作为评价小鼠肠道微生物定植能力的指标。

1.5 粪便中短链脂肪酸的测定

参考WANG G 等[11]的方法对粪便中的SCFAs 进行提取和测定。取上述粪样均质液2mL 在10000r·min-1下离心10 min，吸取1 mL 上清液，加入100 μL的10%硫酸溶液（v/v）酸化，而后加入2 mL 乙醚萃取脂肪酸，静置30 min 后吸取上层乙醚相，加入0.5 g无水硫酸钠进行干燥，静置30 min 后，10 000 r·min-1离心10 min，取上层乙醚相待测分析。

利用气相色谱法检测上述乙醚相中乙酸、丙酸和丁酸的含量，色谱柱为Agilent DB-WAX 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm）。检测过程的升温程序：以10℃·min-1升温速率从80℃加热至110℃，保持1 min，而后以5℃·min-1升温速率升至140℃，保持3 min。采用N2、H2和空气的混合气体作为载气，三种气体的流速分别为25、40 和400 mL·min-1，柱压为15.5 kPa，分流比为30∶1。

1.6 免疫功能测定

实验结束后，从低聚木糖受试组和空白对照组中，各挑取小鼠6 只静脉采血，静置30 min 后离心制得血清，利用南京建成的ELISA 试剂盒测定血清中的免疫相关蛋白（IgG、IgA 和IgM）的含量。

1.7 统计方法

试验数据采用SPSS 21.0 的单因素方差分析（one-way ANOVA）进行分析。采用t 检验比较组间差异显著性，结果以（±s）来表示，P ＜0.05 表示差异显著。

2 结果

2.1 不同品质的低聚木糖对乳杆菌和双歧杆菌生长的影响

本研究通过体外培养考察了不同低聚木糖对乳杆菌和双歧杆菌生长的影响。从图1 可知，RXOS和HXOS 均对植物乳杆菌和德氏乳杆菌的生长具有促进作用。此外，添加0.5% HXOS 对两种乳杆菌的增殖作用还略高于添加1% RXOS，说明HXOS比RXOS 对乳杆菌的增殖作用更强。两种低聚木糖对双歧杆菌的增殖作用呈现了相同的趋势，在不同的添加量情况下，HXOS 对双歧杆菌的增殖作用均显著高于RXOS。上述结果表明，木二糖和木三糖的含量越高，对益生菌的增殖作用越强。

图1 两种低聚木糖对乳杆菌（A）和双歧杆菌（B）生长的影响

2.2 不同低聚木糖对小鼠肠道菌群的影响

本实验考察了两种低聚木糖连续灌胃14 d 对小鼠肠道内3 种微生物生长的影响。从表1 可知，空白对照组小鼠肠道内的肠杆菌和产气荚膜菌数量在实验前后未发生显著变化，但肠球菌的数量与实验前相比显著增加（P ＜0.05）。在连续给予RXOS 14 d后，肠球菌的生长无显著变化，而摄入HXOS 14 d后，同样抑制了肠球菌的生长。不同的低聚木糖对小鼠肠道内肠杆菌的生长呈现了相似的影响趋势，在灌胃两种高剂量的低聚木糖14 d 后，与灌胃前相比，肠杆菌数量显著降低（P<0.05）。两种低聚木糖均显著抑制了小鼠肠道内产气荚膜菌的生长，灌胃两种低剂量低聚木糖14 d 后，产气荚膜菌的数量显著低于正常对照组（P<0.05），此外研究发现在灌胃高剂量时，HXOS 比RXOS 对产气荚膜菌抑制作用更强（P<0.05）。结果表明，低聚木糖能显著抑制肠道中有害菌的生长，并且高剂量木二糖和木三糖对有害菌具有更强的抑制作用。

表1 不同低聚木糖对小鼠肠道菌群的影响[n=12，lg（CFU·g-1）]

通过考察两种低聚木糖对双歧杆菌和乳杆菌生长的影响研究（表1），摄入高剂量的RXOS 14 d后，与空白对照组相比，乳杆菌数量增长了10.5%，与灌胃前相比增长了9.8%。而摄入HXOS 14 d 后，与空白对照组相比，低剂量组和高剂量组中乳杆菌数量分别增长了12%和16.7%，与灌胃前相比分别增加了13.1%和19.5%。同样，两种低聚木糖对双歧杆菌也呈现了显著的增殖作用（P<0.05），其中摄入高剂量的HXOS 14 d 后，与空白对照组、灌胃前和RXOS 高剂量组相比，双歧杆菌的数量分别增加了23%、21%和12.4%。结果表明，低聚木糖能显著增加肠道内有益微生物的生长，并且木二糖和木三糖对有益菌具有更强的增殖作用。

B/E ≥1 表示肠道定植抗力正常，B/E<1 表示肠道定植抗力降低[2]。由表2 可知，灌胃RXOS 14 d后，高剂量组的B/E 值显著增加，在灌胃HXOS 14 d后，低剂量组和高剂量的B/E 值均显著增加，而且高剂量的B/E 值比灌胃普通低聚木糖的高剂量组提高了17.8%。结果表明，低聚木糖具有能够改善肠道菌群结构的功能，而且木二糖和木三糖具有更强的作用效果。

表2 2 种低聚木糖对小鼠肠道菌群B/E 值的影响

2.3 低聚木糖对小鼠肠道内SCFAs 的影响

SCFAs 作为肠道菌群主要的代谢产物之一，对维护宿主的肠道健康具有重要作用[2]。本研究检测了不同的低聚木糖灌胃14 d 后，小鼠粪便中乙酸、丙酸和丁酸的含量（表3），灌胃两种低聚木糖14 d后，不同剂量组中乙酸含量均显著增加（P<0.05），说明摄入低聚木糖能够有效促进小鼠肠道内的微生物代谢产生乙酸，且HXOS 组比RXOS 组具有更高的乙酸含量。丙酸在小鼠肠道内的含量显著低于乙酸和丁酸，灌胃两种低聚木糖14 d 后，RXOS 高剂量组以及HXOS 低剂量组和高剂量组中丙酸的含量增加，差异具有统计学意义，此外HXOS 高剂量组的丙酸含量比RXOS 高剂量组提高了50%。丁酸在维持肠道内环境稳定和预防结肠癌等方面具有优良的作用[12]，灌胃14 d 后在不同组别中，丁酸含量均有所增加，其中RXOS 的高剂量组以及HXOS低剂量组和高剂量组的丁酸含量增加显著，具有统计学意义（P<0.05），而且HXOS 高剂量组的丁酸含量比RXOS 高剂量组提高了36.4%（P<0.05）。上述结果表明木二糖和木三糖相比于其他低聚木糖组分，能更促进SCFAs 的产生。

表3 2 种低聚木糖对小鼠粪便中SCFAs 含量的影响（n=12，mg·g-1）

2.4 两种低聚木糖对小鼠血清免疫球蛋白含量的影响

免疫球蛋白是由浆细胞合成分泌的一组具有抗体活性的蛋白质，主要包括IgG、IgA 和IgM 等五种类型，在体液免疫中发挥重要作用[13]。两种低聚木糖对小鼠血清中免疫球蛋白含量的影响见表4。空白对照组的小鼠灌胃前后免疫球蛋白数量未发生显著变化。与空白对照组相比，IgG 和IgM 含量显著增加（P<0.05），并且比灌胃前分别提高了31.8%和57.5%。然而RXOS 低剂量组的三种免疫球蛋白含量均无显著增加。灌胃HXOS 14 d 后，与空白对照组和灌胃前相比，IgA 的含量未显著变化，但低剂量组和高剂量组的IgG 和IgM 含量均显著增加（P<0.05），并且高剂量组的免疫球蛋白含量高于RXOS的高剂量组，其中IgM 含量的增加了17.5%，表明低聚木糖中木二糖和木三糖含量的增加，提高了小鼠免疫球蛋白的含量，增强了小鼠的体液免疫功能。

表4 2 种低聚木糖对小鼠血清免疫球蛋白含量的影响（n=12，μg·mL-1）

3 讨论

本研究首先通过体外培养发现，与RXOS 相比，HXOS 对双歧杆菌和乳杆菌具有更明显的促进作用，这与RAJAGOPALAN G 等[14]的研究一致。小鼠体内研究同样表明，HXOS 更显著地增加了小鼠肠道内双歧杆菌和乳杆菌的含量，对肠球菌、肠杆菌和产气荚膜菌等有害菌的生长抑制作用更强。并且与RXOS 相比，这种低聚木糖更加促进了小鼠肠道代谢产生乙酸、丙酸和丁酸，提高了肠道内SCFAs的总量。李婉等[12]使用BALB/C 小鼠，连续给予低聚木糖14 d 后，发现粪便中双歧杆菌和乳酸菌等有益菌数量显著增加，有害菌数量显著降低，并且低聚木糖促进了小鼠肠道代谢产生SCFAs。

在给予小鼠灌胃HXOS 14 d 后，血清中IgM 和IgG 的水平显著提高，且比灌胃RXOS 具有更高的促进作用，说明木二糖、木三糖比其他低聚木糖组分对人体的体液免疫具有更好的保护作用。孙攀峰等[15]发现，在断奶仔猪饲料中添加低聚木糖，提高了仔猪血清中IgG 和IgM 的含量，但对IgA 含量没有显著影响，这与本研究结果一致。方桂友等[16]同样发现，添加低聚木糖的仔猪血清IgG 和IgM 含量显著高于空白对照组和抗生素组。陈小连等[4]考察了杨树多酚和低聚木糖对断奶仔猪生长、免疫和抗氧化能力的影响，结果发现在仔猪饲料中添加低聚木糖后，血清中IgA、IgM 和IgG 含量均显著增加。

本研究表明木二糖/木三糖在促进双歧杆菌和乳杆菌等有益菌增殖，抑制有害菌生长，提高机体免疫力等方面比其他低聚木糖组分具有更高的生物活性，因此要推动低聚木糖在食品、保健品上的应用，应尽可能提高产品中木二糖和木三糖的含量以提升低聚木糖产品的品质。