洋葱无蜡粉突变体特性初步研究

惠林冲,潘美红,陈 微,李威亚,何林玉,张仕林,缪美华,陈振泰,杨海峰

(连云港市农业科学院,江苏连云港 222000)

洋葱(AlliumcepaL.)的叶色为绿色,外叶表面有角质层蜡粉覆盖,角质层蜡保护植物并影响许多生理特征,被认为参与角质形成以及针对非生物和生物胁迫的防御反应,如病原菌[1]、昆虫[2]、干旱及低温等[3]。洋葱蜡粉缺失突变体是由普通有蜡粉突变而来,肉眼观察植株表面蜡粉缺失,颜色油绿,有光泽,在葱属植物洋葱[4]、大葱均有突变植株产生,无蜡粉突变受单个隐性基因控制[5-6]。按洋葱表面蜡质含量的多少分为“蜡质型”和“光泽型”[7]。在视觉上介于蜡质和光泽之间的表型,称为“半光泽”,“光泽型”相对于蜡质型具有很少的蜡,并且显示出对洋葱蓟马的抗性[8],但是易受喷雾农药损害,病原体侵入[9]和过度蒸腾的影响[10]。

洋葱的最外层由角质层和表皮蜡组成,蜡主要由植物表皮中的超长链脂肪酸(VLCFAs)及其衍生物组成。这些化合物由两条途径合成,一种途径是酰基还原途径,涉及初级醇和蜡酯的生产[11];另一种途径是脱羰化,包括醛、烷、酮和仲醇的合成,参与种子甘油酯,鞘脂和脂质生物膜的合成,并为蜡质角质层的生物合成提供前体[12]。洋葱5号染色体上的区域可能影响角质层蜡生物合成的脱羰途径[10]。Liu等[13]对大葱无蜡粉突变体转录组测序分析发现,长链脂肪酸代谢,超长链脂肪酸代谢,蜡生物合成和氧化还原,可能参与蜡前体的合成。

自2014年开始田间收集洋葱无蜡粉材料,拟对洋葱无蜡粉田间表型特征、超微结构及蜡质成分进行初步研究,为研究洋葱保持系可视化标记、杂交种纯度及抗葱蓟马调控机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 无蜡粉突变体材料田间性状统计

洋葱试验材料的生态类型为中日照,全部来自于连云港市农业科学院蔬菜研究室。2017年11月在资源圃中挑选出无蜡粉突变体洋葱苗,2018年5月收获种球,10月种球种植,2019年5月花期进行单株套袋自交,收获的种子于9月份全部播种育苗,11月定植。选取3个黄皮和3个紫皮品种有蜡粉洋葱为对照,正常使用农药管理,无蜡粉20份材料,正常肥水管理,全程不使用任何农药,2020年4月统计洋葱膨大初期株高、叶片开展度、叶形、蓟马数量,5月中下旬统计熟期、平均单球质量。每个小区15 m2,重复3次,随机分布。5月下旬洋葱膨大末期,观察蓟马危害洋葱叶片情况,统计洋葱受害叶面积,建立无蜡粉突变体抗蓟马评价体系。

对19212、19238、19061 3份材料与有蜡粉采用人工去雄与辅助授粉的方式进行正反杂交,每花球留15～25朵花,套羊皮纸袋,重复3次。收获的F1进行自交,检测F2代分离比。

1.2 叶绿素含量的测定

在洋葱球膨大初期,取新叶组织0.05 g,在液氮下研磨,放入50 mL试管中,加25 mL的95%乙醇混匀置于黑暗条件下,2 h后,取上清液于652 nm波长下比色测OD值,重复3次[14]。

叶绿素含量(鲜质量%)=(OD652×V)/34.5×W

式中:V为提取液总量(mL);W为叶片鲜质量(mg)。

1.3 洋葱叶片超微结构观察及蜡质成分分析

取19061材料有蜡粉和无蜡粉的叶片进行超微结构观察。将叶片横切成面积5 mm×5 mm大小,然后用2%的锇酸熏蒸 24 h,自然风干 24 h,用银胶固定在样品台上,喷金,于SEM扫描电镜下进行观察[15]。

将叶片浸没在装有15 mL 正己烷的玻璃试管中提取30 s,再在每个样品中加入20 μg 正24碳烷烃(C24,SUPELCO,Sigma)标样作为内标,然后用氮气吹干。加入100 μL N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA,SUPELCO,Sigma),90 ℃恒温箱衍生30 min。然后用氮气吹干衍生剂,加入1 mL 正己烷溶解样品,过滤转移至新的色谱瓶。采用气相色谱仪质谱仪(Thermo Trace1310 ISQ)分析样品,色谱柱:30 m×0.25 mm×0.25 μm;柱温:初温60 ℃保持5 min,以 3.5 ℃/min升至100 ℃,保持5 min;再以 8 ℃/min升至200 ℃,保持5 min;再以 15 ℃/min升至280 ℃,保持15 min;进样口温度:280 ℃;载气流速:1.2 mL/min;不分流;质谱条件:离子源温度:280 ℃,传输线温度:250 ℃;质谱:EI源 轰击电压:70 eV。自动检索各组分质谱数据,对照标准谱图及参考相关文献对机检结果进行核对,确定成分,按面积归一化法计算各组分含量[16]。

1.4 洋葱无蜡粉突变材料SSR筛选及差异分析

利用前期无蜡粉与有蜡粉转录组测序获得的SSR引物进行筛选分析,随机选取335对引物对同一株有蜡粉植株自交分离的无蜡粉和有蜡粉材料验证,取新鲜叶片,液氮研磨,采用北京天根DNA试剂盒(型号:DP350-03)提取洋葱基因组DNA,引物由福州白鲸生物科技有限公司合成(表1),PCR扩增试剂购置于TAKARA公司,反应体系为25 μL,包括:2 μL DNA(0.1 μg), 2.5 μL 10× PCR buffer,1.25 μL(10 μmol/L)正向引物,1.25 μL(10 μmol/L)反向引物,2 μL dNTPs(10 mmol/L),0.25 μLTaq酶和 15.8 mL ddH2O,95 ℃预变性 5 min;95 ℃变性 30 s、58 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s,35个循环;72 ℃再延伸 10 min。扩PCR产物采用9%的聚丙烯酰氨凝胶垂直电泳检测,电压100 V,电泳 3 h,硝酸银染色,相机在胶片灯上拍照记录[14]。对筛选出有差异位点的引物,选用19212、19238、19061 3份材料有蜡粉和无蜡粉的材料进行标记验证。

表1 洋葱SSR标记引物

2 结果与分析

2.1 洋葱突变材料形态特征及主要农艺性状

2.1.1 洋葱无蜡粉突变株叶片颜色鉴定 无蜡粉洋葱苗期因叶片小很难发现,叶片颜色较正常植株呈亮绿色,有光泽(图1-B),种球秋季种植发芽后全株叶片均表现无蜡粉特征(图1-A左),花薹表面无明显白色蜡粉,但有一层薄薄的透明粉层(图1-B);正常植株叶片表面覆盖白色蜡粉层(图1-A右),花薹颜色绿色表面泛白(图1-C)。

对19212、19238、19061 3份材料与有蜡粉正反授粉,F1均有蜡粉,套袋单株自交后F2苗期叶片出现分离,有蜡粉与无蜡粉分离比为约为3∶1(表2),表明洋葱叶片蜡粉受隐性单基因控制。

2.1.2 洋葱无蜡粉突变株农艺性状 对洋葱球型、皮色、熟期、叶形、茎高、叶片开展角度、平均单球质量、使用杀虫剂和未使用杀虫剂后蓟马数量等农艺性状统计观察,前期在紫皮、黄皮和白皮均有收集到无蜡粉突变株,但白皮和黄皮材料突变数量比较少。无蜡粉洋葱苗期长势比正常的要弱,叶片细长,熟期较晚,但对产量的影响不大,与自身的材料有关,19212、19233单球质量分别达326 g、352 g(表3),已达到市场商品种的单球质量。另外由于苗期长势弱,达不到春化抽薹的标准,因此无蜡粉突变体均未发生抽薹,对照组抽薹在3%～5%。不同洋葱球膨大初期叶绿素含量之间差异显著,有蜡粉772、1924、1937 3份总叶绿素含量较高,952、1870、1922有蜡粉与无蜡粉叶绿素含量差异显著,另外叶绿素含量多少与洋葱单球质量之间无相关性,田间调查发现洋葱19212虽然叶片直立,叶绿素含量少,但单球质量高达326 g,说明叶片生物学转化率高,适合高密度栽培提高产量,同时茎杆高达11.5 cm,适合未来发展机械化去秧。尽管19233单球质量最高352 g,单叶片粗、叶片顶部弯,开展度也达最大60°,田间整体效果不适合高密度栽培和机械化 发展。

表3 洋葱生物学数据统计

茎高和叶片开展度对蓟马影响不大,对照正常有蜡粉材料772、952、1870、1922、1924、1937在未使用杀虫剂的情况下,蓟马数量显著高于无蜡粉材料,与使用杀虫剂后的效果差不多,表明无蜡粉突变体材料在不使用杀虫剂的情况下能够达到抗葱蓟马的效果(表3)。

蓟马主要危害洋葱叶片表面结构,啃食过后会在洋葱叶表面留下白色伤斑(图2),无蜡粉洋葱叶片蓟马数量少,说明无蜡粉叶片对蓟马无吸引力,或者蓟马对其产生抵触。根据无蜡粉洋葱叶片被蓟马危害情况,建立评价田间自然条件下无蜡粉突变体对不同蓟马的抗性级别标准 (表4)。

表4 洋葱无蜡粉突变体抗蓟马评价标准

2.2 洋葱叶片表面超微结构观察

洋葱膨大初期叶片快速生长,突变型与正常叶片视觉光滑度差异极为显著,正常洋葱叶片覆有蜡粉层,突变体叶片光滑,颜色亮绿。电镜观察(图3)发现正常叶片表面有蜡质晶体,以颗粒状为主,分散均匀;无蜡粉叶片表面有少量细小的颗粒状晶体、无聚集,说明无蜡粉突变体叶片并不是没有蜡质,而是蜡质晶体非常少,肉眼不足以观 察到。

箭头指向为蜡质晶体;A.正常有蜡粉洋葱;B.无蜡粉突变体洋葱

洋葱盛花期间,整个花薹的蜡粉会越来越多,形成白色蜡粉霜层,用手轻轻擦拭会露出绿色组织(图4-A,4-C),手上留有白色蜡粉;而无蜡粉突变体叶片生长过程中观察均无明显白色蜡粉,但在花薹后期表面有一层光亮的蜡质,用手擦拭明显感觉到一层透明蜡粉被擦拭下来(图4-B, 4-D),说明无蜡粉突变体并不是绝对无蜡粉。

A.有蜡粉花薹; B.无蜡粉洋葱花薹;C.有蜡粉花薹表面蜡粉层被擦除后;D.无蜡粉花薹表面蜡粉被擦除后

2.3 洋葱叶片蜡质成分分析

采用气相质谱仪对洋葱膨大初期叶片表面蜡质成分进行分析,正常叶片与无蜡粉叶片分别离鉴定出46和41种化合物,两者相同化合物有20种,其他均不同。相同的化合物均占总量的92%以上,两者不同的化合物占比非常少,两种洋葱叶片蜡质成分相对含量高的9种化合物,有蜡粉与无蜡粉叶片蜡质化合物分别占总量的96.07%、91.47%,表明洋葱无蜡粉叶片的表面并不缺乏蜡质成分。洋葱有蜡粉与无蜡粉叶片蜡质主要成分含量对比发现,16-三十一酮在无蜡粉叶片中由相对含量52.66%降低到2.79%,芥酸酰胺和和2,2′-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)两种化合物含量在无蜡粉叶片中均增加。其他化合物含量占比均差异不明显,另外在各自含量较多的9种化合物中,二十五烷和14-二十九烷酮在无蜡粉单独检测出,两者相对含量占7.77%;二十八烷和醚菌酯在有蜡粉叶片单独有检测出,两者相对含量占4.17%(表5),表明这几种增加和独有的化合物对洋葱叶片蜡粉的视觉表型可能无影响,而蜡粉中含量最高的16-三十一酮含量的减少是影响洋葱无蜡粉突变体表型的主要化合物。

表5 洋葱叶片蜡质成分化合物相对含量

2.4 洋葱无蜡粉突变材料SSR筛选及差异分析

利用355对SSR引物对洋葱19061材料单株自交分离无蜡粉和有蜡粉叶片混合DNA进行筛选,有19对引物未扩增出条带,在剩余的336对引物中筛选出两对引物196和引物304扩增有差异条带,196引物在无蜡粉中缺200 bp条带的差异,差异条带清晰明显(图5),引物304条带较为淡,其他引物均无差异或差异不明显。为验证两对引物是否能够区分其他无蜡粉与有蜡粉植株,发现并不能够区分有蜡粉与无蜡粉植株,而对19061材料的有蜡粉与无蜡粉单株DNA检测发现,同样是不能够区分无蜡粉与有蜡粉,而只能区分其中的一株材料具有差异位点,所以引物196和304不能作为分子标记来区分洋葱有蜡粉与无蜡粉材料,作为单株特异性标记。

3 讨 论

植物表面蜡质具有防止非气孔的水分散失、病虫害的侵入和太阳辐射的生物学功能[17],洋葱叶片无蜡粉突变体在整个生育周期中,叶片均表现出无蜡粉的特征,叶片表现亮绿色,能够明显区分正常洋葱;正反交遗传表明受隐性单基因控制,与前人研究大葱[5]、洋葱[18]、小青菜[19]和甘蓝[20]等叶片无蜡粉突变遗传规律一致。

从收集到的无蜡粉材料中,部分洋葱球产量达到商品种的标准,尤其是无蜡粉材料苗期长势弱,从而避免返春先期抽薹的情况。从表型观察到无蜡粉叶色为亮绿色,但总叶绿素含量相对正常有蜡粉洋葱低,也进一步解释苗期相对弱的情况。

植物角质层蜡参与角质形成以及针对非生物和生物胁迫的防御反应[21]。甘蓝叶表皮蜡质含量与跳蚤甲虫、卷心虫生物造成的伤害程度之间均存在明显的负相关[22],研究表明甘蓝表皮蜡是抗虫的重要物质[23]。但洋葱无蜡粉突变体表现出抗葱蓟马的特征,在不使用农药的情况下无蜡粉突变体上蓟马数量和有蜡粉使用杀虫剂效果基本相同,另外不同的材料之间的抗蓟马程度也不相同。与国外研究洋葱无蜡粉突变体抗蓟马结果基本一致,发现不同基因型的洋葱叶的颜色和蜡质对蓟马抗性有关:浅绿色至绿色的叶子,叶片蜡含量少,叶子光滑的基因型具有抗性,而叶子不光滑、有蜡粉的基因型易感蓟马[24-25]。另外,研究发现洋葱的叶片表皮可以作为取食的引诱剂,因此,更薄的表皮厚度可以减少蓟马的危害[26]。

在有蜡粉(非突变体)洋葱研究抗蓟马中发现,具有封闭(紧密)叶腋纹(开展度),蓝色至深绿色叶色和蜡质叶是洋葱蓟马的优选,而具有开放叶腋形图案,浅绿色叶色和光泽(非蜡质)叶子对蓟马具有一定的抗性[27]。在本研究洋葱无蜡粉突变体中,蓟马数量多少与叶片开张度关系不大,因为本身无蜡粉具有抗蓟马特征,蓟马数量相对少,同时蓟马是昼伏夜出,所以开张度越小越有利于蓟马的躲藏。不同作物中葱蓟马对颜色的吸引有所不同,马铃薯田间调查发现葱蓟马表现出对中绿色的偏爱,而不是红色、蓝色和白色[28]。在白、黄、蓝、荧光黄诱捕剂对葱蓟马的引诱作用,发现荧光黄诱捕的蓟马最多[29],洋葱无蜡粉突变体叶片颜色的变化,可能对葱蓟马有一定的影响。

本研究对无蜡粉突变和有蜡粉洋葱膨大初期的叶片蜡质成分进行检测分析,发现蜡质主要成分为酮、脂肪醇和烷三大类,尽管鉴定有46种化合物,但洋葱蜡质主要成分是16-三十一酮,而无蜡粉叶片16-三十一酮的大量减少导致叶片表现出无蜡粉的特征,与前人研究一致,16-三十一酮是负责洋葱叶片上的视觉蜡质。在视觉上介于蜡质和光泽之间的 “半光泽”[7],可以保护叶子免受疾病或环境胁迫,同时仍然赋予对洋葱蓟马的抗性。Munaiz等[30]研究蜡质成分检测也发现无蜡粉突变体并不缺失主要蜡质成分,只是部分含量的减少,尤其的洋葱抽薹开花后期,大量的白色蜡质集中在花薹上形成白霜层,无蜡粉突变体也产生少量的白色蜡质晶体,与电镜扫描观察结果相一致,进一步说明16-三十一酮在表型蜡粉中起关键作用。

研究发现16-三十一酮是控制蜡粉的主要成分,酮类化合物代谢合成途径中cer1基因被鉴定为控制甘蓝光泽表型的候选基因,39 bp缺失导致mRNA破坏并降低BrCER1基因的表达。序列分析表明,Brcer1基因的功能缺失突变与Cgl1不同,Cgl1之前已被证明是甘蓝中光泽表型的原因[19],显示了典型的平行选择,对洋葱表皮蜡生物合成途径提供研究思路。

为了进一步开发洋葱无蜡粉突变体分子相关标记,利用无蜡粉突变体测序获得的转录组SSR进行筛选,在混和DNA样品19061中比较有蜡粉与无蜡粉差异位点,初步筛选出196和304两对有差异位点的引物,但利用其他无蜡粉材料的DNA进行验证,并不是无蜡粉特异分子标记,需要进一步通过测序分析碱基情况。 为直接应用洋葱无蜡粉突变体抗葱蓟马特性,后期课题组将会从综合性状优良的材料中,利用jnurf13分子标记筛选保持株做父本,创制抗虫不育系,直接应用生产全不育型洋葱无蜡粉抗虫杂交新品系,为国内洋葱自主创新育种奠定基础。