不同氮利用效率小麦品种TaNRT/TaNPF家族基因表达特点

王露露 仪子博 王浩哲 能芙蓉 马新明 张志勇,* 王小纯,,*

不同氮利用效率小麦品种TaNRT/TaNPF家族基因表达特点

王露露1仪子博1王浩哲1能芙蓉2马新明1张志勇1,*王小纯1,2,*

1省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室 / 河南农业大学, 河南郑州 45000;2河南农业大学生命科学学院, 河南郑州 450002

氮素是小麦生长发育的必需元素之一, NO3–-N是小麦从土壤中获取氮的主要形式。NRT/NPF家族基因编码膜转运蛋白, 主要参与植物NO3–-N吸收、运输及分配。为了解小麦NRT/NPF家族基因与氮素利用的关系, 选用氮高效小麦品种周麦27 (ZM27)和氮低效品种矮抗58 (AK58), 利用二代测序技术, 研究了不同氮水平(N120、N225、N330)开花期TaNRT/TaNPF家族基因在旗叶中的表达特点。结果表明, 二代测序鉴定到386个TaNRT/TaNPF家族基因; 与AK58相比, ZM27在氮减量(N120)、正常(N225)、过量(N330)条件下差异表达基因分别为27、16和23个, 上调表达基因分别为16 (59.26%)、12 (75%)和19 (82.61%)个; 减氮条件下ZM27有7个特异下调表达基因, 氮过量条件下TaNPF8.1表达量最高, 且显著上调1.5倍。可见, TaNRT/TaNPF家族基因表达水平受施氮量及品种调控。利用小麦网络数据库分析发现TaNRT/TaNPF家族基因表达具有组织特异性及染色体偏好性, 旗叶表达量最高的TaNPF8.1定位于3A染色体, 根系特异表达的TaNRT2.2和TaNRT3.1主要分布于6号染色体, 茎秆特异表达的TaNPF4.5主要分布在2号染色体。qRT-PCR分析显示TaNRT/TaNPF基因表达特点与二代转录组及网络数据结果一致。TaNPF8.1、TaNPF4.5和TaNRT3.1蛋白互作分析发现, NO3–-N转运可能还需要转录因子MYB、叶绿素A-B结合蛋白、伴侣蛋白等协同参与, 为进一步研究TaNRT/TaNPF家族表达与氮素吸收利用的关系奠定了基础。

小麦; NRT/NPF; 氮效率; 差异表达; 组织特异性

氮素是小麦生长发育过程中必需的大量元素之一, 是小麦产量与品质形成的重要限制因素[1]。硝态氮(NO3–-N)和铵态氮(NH4+-N)是植物的两种无机氮源[2], 小麦无机氮吸收转运以NO3–-N为主[3-4]。根系吸收的NO3–一小部分直接同化以支持生长, 大部分通过茎杆运输到叶片中同化或储存于液泡中供以后使用, 完成这些过程需要植物有效地感知外部氮素供应水平, 并且通过代谢酶和转运体调节不同组织的氮需求[2]。

植物体内参与NO3–转运的家族包括NPF (Nitrate transporter 1 (NRT1)/Peptide transporter (PTR) family)、NRT2 (Nitrate transporter 2)、NRT3 (Nitrate transporter 3)、CLC (Chloride channel family)和SLAC (Slowly activating anion channel)[5-6]。NPF分为NPF1-NPF8亚家族, 包括低亲和力的硝酸盐转运体、双亲和力硝酸盐转运体及多肽转运体[7]。大多数NPF转运体为低亲和力硝酸盐转运体, AtNPF6.3/NRT1.1/CHL1和OsNPF6.5/OsNRT1.1b对NO3−具有双重亲和力[8]。NRT2和NRT3为高亲和力的硝酸盐转运体[9]。氯离子通道蛋白(CLC)主要转运Cl–, 也转运分子量相近的NO3−; 慢阴离子通道蛋白(SLAC)主要在植物阴离子(Cl–、NO3–等)摄取和气孔开闭过程中起到重要作用[10]。植物NO3–吸收转运主要由NRT/NPF家族完成。

NRT/NPF家族不同成员组织定位不同, 功能也不尽相同。在拟南芥中, 只有AtNRT2.7定位于种子液泡膜外[11], 其他AtNRT2成员均定位为根系, 参与根系NO3–的吸收, 缺氮诱导AtNRT2.5表达[12]。AtNRT3定位于根系, 是一种高亲和力NO3–转运体, 还可以促进NRT2.1的转运活性[13]。AtNPF1定位于展开叶主脉的伴胞中, 参与NO3–向幼叶的分配[14]。AtNPF2分布于拟南芥根系、叶片、花药及花丝等部位, 参与根系韧皮部NO3–装载[15]、盐胁迫下根-茎NO3–转运[16]、根系NO3–外流[12]以及再分配等[17]。AtNPF3定位于叶片次脉、下胚轴、花药与花丝交界处及根内皮层, 与叶片中NO3–积累有关[18]。AtNPF4定位于根毛和根表皮, 参与NO3–吸收[19]。AtNPF5定位于拟南芥根系和叶片维管束, 参与液泡NO3–外排[20]。AtNPF6主要参与根系NO3–转运[6]。AtNPF7参与木质部NO3–转运[21]。AtNPF8与根系小肽吸收密切相关[22]。OsNPF2定位于根表皮、根木质部薄壁组织, 参与根冠NO3–摄取、转运和远距离运输[23-24]。OsNPF6定位于水稻根毛、根表皮及维管组织, 决定不同品种水稻的NO3–利用效率[25]。OsNPF7定位于根厚壁组织、皮层、侧根、茎及花柱, 参与细胞内及各组织间NO3–分配[26]。OsNPF8.1则调节二甲基砷酸盐在叶、节、根中的积累[27]。根系可感知外界NO3–浓度并调节侧根及根毛发育, 氮浓度也可作为信号调控植物体地上与地下部的含氮物质运输[28]。

小麦NRT/NPF基因家族庞大, 包括NPF (NPF1-NPF8)亚家族[8]、NRT2和NRT3, 前人研究表明小麦NPF基因表达受施氮和发育的调控[5], 但与氮代谢相关功能研究较少, 与小麦氮素利用效率相关的分子机制尚不明确。小麦旗叶与产量形成关系密切, 开花期旗叶NO3–积累为后期灌浆过程含氮化合物向籽粒运输提供物质基础[29]。因此, 本试验以不同氮处理(N120、N225和N330)的氮高效品种周麦27 (ZM27)和氮低效品种矮抗58 (AK58)开花期旗叶为材料, 通过二代测序分析氮处理对不同氮效率小麦品种NRT/NPF家族基因表达的影响, 并利用网上数据库分析NRT/NPF基因家族在小麦不同组织器官中的表达特点, 为进一步深入研究小麦NO3–吸收、转运、分配、同化分子机制奠定基础, 也为氮肥减量及氮高效率小麦品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2018年10月16日滑县试验农场大田播种, 播种行距20 cm, 基本苗375万株hm–2。试验品种是课题组在执行国家自然基金(31271650, 2012—2016年)时, 从河南省近10多年来推广的30个小麦品种中筛选的典型氮高效品种周麦27 (ZM49)和氮低效品种矮抗58 (AK58)。2013—2019年连续6年大田试验显示2个品种的氮效率在不同生态类型区表现稳定, 氮效率差异显著。土壤类型为潮土, 含水量14.65%。小麦播种前土壤基础养分含量为: 有机质20.53 g kg–1、全氮1.01 g kg–1、全磷1.96 g kg–1、全钾8.43 g kg–1、速效磷55.3 mg kg–1、速效钾382.85 mg kg–1、硝态氮17.83 mg kg–1、铵态氮13.85 mg kg–1。试验小区长16 m, 宽7.5 m, 每个小区设3个重复。设置3个施氮处理, 即减氮120 kg hm–2(N120)、正常氮225 kg hm–2(N225)、过量氮330 kg hm–2(N330), P2O5和K2O各225 kg hm–2。肥料在播种前一次施入, 其他管理同一般高产大田。于小麦开花期选取长势均匀一致的旗叶, 每个处理重复3次, 液氮处理后于–80℃冰箱保存, 用于二代转录组测序。花后16 d选取N120和N225处理下长势均匀一致的植株用铁锹连根挖出(深40 cm), 用剪刀剪掉所有根系并清洗干净, 地上部取籽粒(穗中部饱满的籽粒)、旗叶、旗叶鞘、茎(穗下节), 液氮处理后于–80℃冰箱保存, 用于qRT-PCR检验。

1.2 二代测序

将上述样品分别于液氮中研磨成粉状, 将开花期旗叶样品送百迈客生物科技公司提取RNA并测序。用TRIzol试剂(Thermo Scientific, 美国)提取总RNA, 用安捷伦RNA 6000纳米试剂盒及安捷伦2100生物分析仪分析RNA完整性(Agilent Technologies, 美国)[30], 用NEBNext Ultra RNA试剂盒Illumina (New England Biolabs, 美国)建立测序文库, 用IlluminaHiSeq 4000平台(Illumina, 美国)进行双末端测序, 生成150 bp长的reads[31]。通过删除接头及含ploy-N的低质量reads, 从原始数据中获得约82,011,596个可信reads。用TopHat v2.0.12将这些reads比对到Ensembl Genomes (fttp://ftp.ensemblgenomes. org/pub/plants/release32/fasta/triticum_aestivum/cdna/Triticum_aestivum.TGACv1.cdna.all.fa.gz; release32)的中国春小麦的cDNA数据库中(http://ccb.jhu.edu/ software/tophat/index.shtml)[30]。共获得78,319个转录本, 其中24,607个(31.4%)来自A基因组, 25,573个(32.7%)来自B基因组, 24,952个 (31.9%)来自D基因组, 3187个(4.1%)来自未知染色体组。通过下式计算相对表达量。

1.3 荧光定量PCR

为验证转录组数据是否可靠, 采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)对随机选取的10个基因进行验证, 包括: 硝酸转运蛋白基因()、()、()、()、()、(); 查耳酮合成酶(); 肽转运蛋白基因(); 过氧化物酶(); 抗病蛋白基因() (表1)。使用TRIzol试剂(Thermo Scientific, 美国)并按照说明书提取不同组织器官总RNA。使用带有gDNA Eraser的PrimeScript RT试剂盒(Perfect Real Time) (TaKaRa, 中国大连)进行逆转录制备cDNA。用TBGreen Premix ExII (Tli RNase H Plus)试剂盒(TaKaRa, 中国大连)和StepOne Plus Real- Time PCR仪器(Bio-Rad, 美国)进行qRT-PCR, 设置3个生物学重复。以和为内参, 利用2–ΔΔCT方法计算基因相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 TaNRT/TaNPF鉴定及其表达量分析

基于二代测序数据库, 通过Swiss-Prot注释检索Nitrate Transporter关键词, 查找NRT/NPF基因家族。通过检索Nitrate Transporter在网上数据库(https://www.wheatproteome.org/)查找NRT/NPF基因家族, 下载小麦穗、籽粒、叶、茎、根NRT/NPF家族基因表达量相关数据。该数据库属于源数据库, 由国际小麦测序联盟发布, 收录了小麦Zadoks在70 (开花后至水熟期前)、71 (水熟期)、75 (乳熟中期)、83 (面团早期)、85 (软面团期)时期各组织的基因及蛋白表达数据。

1.5 数据分析

二代测序数据采用DESeq R包(1.18.0)[28]通过比较ZM27和AK58的归一化数据来评估基因表达差异。差异倍数≥1.5且FDR < 0.05的转录本被认为是差异表达基因(DEGs)。筛选FPKM≥5的基因, 利用TBtools软件做热图、韦恩图及TaNRT/TaNPF家族基因染色体定位。利用Cytoscape软件v3.7.1 (http://www.cytoscape.org/)进行蛋白互作(PPI)分析, 置信得分>0.4, 节点代表蛋白质, 节点间的连线代表PPI网络中两个蛋白间的相互作用。通过AI (Adobe Illustrator 2022)对图片进行修饰。

2 结果与分析

2.1 小麦TaNRT/TaNPF基因家族在不同器官中的表达特点

从二代转录组数据库中鉴定到TaNRT/TaNPF家族基因386个, 从网络数据库中鉴定到104个TaNRT/TaNPF家族基因, 选择FPKM≥5的基因进行差异表达分析。网上数据库分析显示(图1-A), TaNRT/TaNPF在小麦不同组织器官中表达存在差异性, 根系表达量最高, 其次为茎, 叶片中表达量较低。根系中表达量高的基因编码高亲和力和双亲和力硝酸盐转运体, 包括TaNRT3.1、TaNPF6.3和TaNRT2.2。依据基因表达丰度, 编码TaNRT3.1的基因有9个, 据表达量依次为、、、、、、、及; 编码TaNPF6.3的基因表达依次为和; 编码TaNRT2.2的表达量较高, 其他染色体上基因表达量相近。TaNPF4.5主要在茎中表达, 依据表达量大小依次为和。叶片中主要表达基因是TaNPF6.4, 依据表达量大小依次为、和基因。二代转录组数据分析显示(图1-B), 开花期旗叶是TaNPF2.11、TaNPF6.3、TaNPF8.1和TaNPF8.5基因的主要表达组织, 由1A、1B、2A、3A、5A、5B、5D染色体上基因编码; 其中TaNPF8.1家族中表达量最高, 其次是。网上数据库与二代测序相比, 叶片中主要表达基因不完全一致, 可能因为网上数据库中叶片表达量为不同品种、不同生育期及不同处理叶片的多样品的平均值。

2.2 氮水平对不同氮效率小麦品种TaNRT/TaNPF家族基因表达影响

利用二代转录组测序技术鉴定分析了不同氮水平、不同氮效率小麦品种旗叶中TaNRT/TaNPF家族基因的差异表达(DEGs)。与AK58相比, ZM27在氮减量(N120)、正常(N225)及过量(N330)处理的DEGs分别为27、16和23个; 其中, 上调表达基因分别为16个(59.26%)、12个(75.00%)和19个(82.61%), 下调表达基因分别为11个(40.74%)、4 (25.00%)和4个(17.39%) (图2-A)。氮减量、正常及过量处理特异上调表达基因分别为7个(43.75%)、5个(41.67%)和10个(52.63%), 共同上调表达基因5个(图2-B); 不同氮处理共同下调表达基因4个, 此外, 氮减量(N120)有7个特异性下调表达基因(图2-C)。可见, 与氮低效品种AK58相比, 氮高效品种ZM27在不同氮处理下TaNRT/TaNPF家族差异基因大多上调表达, 减氮处理ZM27有特异的下调表达基因, 这可能是两个氮效品种对氮感知及氮效率差异的原因之一。

图1 TaNRT/TaNPF家族基因差异表达分析

A: 数据来自网络数据库(https://www.wheatproteome.org/), 蓝-白-红表示基因表达量由低到高; B: 数据来自二代转录组测序。

A: data are from the online database (https://www.wheatproteome.org/); blue-white-red indicates the relative expression level from low to high, B: data are from the second-generation transcriptome sequencing.

图2 不同品种不同氮水平下TaNRT/TaNPF家族基因在旗叶中差异表达特点

A: 不同品种不同氮水平下TaNRT/TaNPF家族在旗叶中的差异基因数, 红箭头: 上调基因, 绿箭头: 下调基因; B: 不同氮水平下TaNRT/TaNPF上调表达基因数; C: 不同氮水平下TaNRT/TaNPF下调表达基因数.

A: the number of TaNRT/TaNPF DEGs. red arrow: the up-regulated gene; green arrow: down-regulated gene. B: the number of up-regulated genes in TaNRT/TaNPF family in different nitrogen levels; C: the number of down-regulated genes in TaNRT/TaNPF family in different nitrogen levels.

两个不同氮效率小麦品种旗叶TaNRT/TaNPF家族DEGs分析发现(附表1), 与AK58相比, ZM27所有上调基因中TaNPF8.1 (和)表达量最高, 且氮过量处理表达量显著上调。氮减量、正常及过量处理ZM27均上调表达基因有TaNPF2.11 (和)、TaNPF4.4 ()、TaNPF8.1 ()及TaNPF8.3 ()。ZM27所有下调基因的表达量相对较低, 其中TaNPF8.3 ()表达量最高, 在减氮条件下表达量显著下调1.5倍; 不同氮处理均下调表达的基因包括TaNRT2.4 ()、TaNPF5.10 ()、TaNPF4.6 ()和TaNPF8.3 ()。小麦开花期TaNPF8.1主要在旗叶中表达, 在氮过量条件下该基因在ZM27较AK58显著上调表达1.5倍。小麦TaNRT/TaNPF基因家族表达水平受品种及施氮量调控。

为了验证转录组分析数据集的可靠性, 利用qRT-PCR分析从DEGs中选择的10个基因, 并与RNA-Seq分析获得的归一化数据进行比较。2个品种3个氮水平的qRT-PCR结果与RNA-Seq结果一致(图3), 且两者之间存在显著的正相关关系, 证明RNA-Seq分析结果可靠。

利用qRT-PCR分析了不同组织器官的TaNRT/ TaNPF家族基因表达, 结果显示TaNPF8.1、TaNPF4.5、TaNRT2.2和TaNRT3.1分别在叶、茎、根中表达量最高, 与二代转录组及网络数据结果一致(图4)。此外, TaNPF8.1、TaNPF4.5、TaNRT2.2和TaNRT3.1还在叶鞘和籽粒中表达, TaNPF8.1在各组织中表达量均较高。TaNPF8.1减氮处理条件下表达量下调; 与AK58相比, ZM27在减氮/正常氮条件下均上调TaNPF8.1表达量。TaNRT4.5在各组织中表达量较低, 氮处理对其表达量无显著影响, 且两品种间表达量亦无显著差异。TaNRT2.2和TaNRT3.1在减氮处理下表达量上调; 与AK58相比, 减氮处理条件下ZM27中TaNRT2.2和TaNRT3.1表达量上调, 正常氮处理下其在ZM27中表达量下调。可见, 不同TaNRT/TaNPF基因在不同品种中对氮的响应存在显著差异。

图3 qRT-PCR验证转录组数据

A: 所选差异表达基因qRT-PCR检测; B: 所选基因对应的FPKM值。矮抗58: AK58; 周麦27: ZM27。N120: 减氮120 kg hm–2; N225: 正常氮225 kg hm–2; N330: 过量氮330 kg hm–2; NPF5.10-1A、NPF5.10-2D、NPF8.1-3A、NPF8.3-1B、NPF8.3-4A、NPF8.3-4D: 硝酸转运蛋白; CHS2: 查耳酮合成酶2; PR1: 致病相关蛋白1; POD70: 过氧化物酶70; RPP13: 抗病蛋白。

A: the relative expression level of selected differentially expressed genes detected by qRT-PCR; B: FPKM values corresponding to selected genes. AK58: Aikang 58; ZM27: Zhoumai 27; N120: nitrogen reduction 120 kg hm–2; N225: normal nitrogen 225 kg hm–2; N330: excess nitrogen 330 kg hm−2; NPF5.10-1A, NPF5.10-2D, NPF8.1-3A, NPF8.3-1B, NPF8.3-4A, NPF8.3-4D: nitric acid transporter gene; CHS2: Chalcone synthase2-like; PTR1: Peptide transporter1; POD70: Peroxidase70; RPP13: disease resistance protein RPP13.

蓝-白-红表示基因表达量由低到高。TaNPF8.1、TaNPF4.5、TaNRT2.2、TaNRT3.1: 硝酸转运蛋白; Root: 根系; Peduncle:穂下节; Leaf: 旗叶; Sheat: 旗叶鞘; Grain: 籽粒; 缩写同图3。

Blue-white-red indicates gene relative expression level from low to high. TaNPF8.1, TaNPF4.5, TaNRT2.2, TaNRT3.1: nitric acid transporter. Abbreviations are the same as those given in Fig. 3.

2.3 不同氮效率小麦品种旗叶中TaNRT/TaNPF家族差异基因功能分析

由于小麦注释信息不完整, 将上调和下调DEGs的氨基酸序列比对到拟南芥和水稻等基因组上, 根据Gene Ontology (GO)数据库对其生物学功能进行预测[5](图5)。发现TaNRT2.3和TaNRT2.4可能参与小麦根部NO3–吸收, TaNRT2.11参与根部-地上部的NO3–运输, TaNPF6.2可感知外界硝酸盐浓度并参与小麦根部NO3–吸收及根部–地上部的NO3–运输, 这些基因与网络数据库主要组织分布一致。TaNPF5.13可能通过液泡硝态氮释放调控根与地上部之间的硝态氮分配。TaNPF8.1、TaNPF8.3和TaNPF8.5可能参与根系小肽吸收及营养器官到萌发花粉的小肽运输。TaNPF5.8可能与种胚氮积累密切相关。可见, TaNRT/ TaNPF广泛参与小麦NO3–吸收、运转、积累及再分配等过程, 对小麦氮素利用极为重要。

图5 TaNRT/TaNPF家族差异基因功能预测

蓝-白-红表示基因表达量由低到高。

Blue-white-red indicates gene relative expression level from low to high.

2.4 TaNRT/TaNPF家族差异基因的染色体定位

器官特异表达TaNRT/TaNPF家族差异基因的染色体分布如图6-A所示, 主要在叶中表达的TaNPF8.1、TaNPF8.3分布在3号和7号染色体长臂上, TaNPF8.5主要由2号染色体表达, 且在长臂及短臂均有表达。主要在茎中表达的TaNPF4.5位于2号染色体长臂靠近着丝粒及7号染色体长臂。主要在根中表达的TaNPF6.3位于1号和4号染色体长臂, TaNRT2.2和TaNRT3.1主要由6号染色体表达, 且在长臂及短臂均有表达。氮响应的TaNRT/TaNPF家族差异基因的染色体分布如图6-B所示, 减氮(N120)条件下TaNRT/ TaNPF家族上调/下调表达的基因包括TaNPF5.1、TaNPF5.10、TaNPF5.13、TaNPF6.3、TaNPF7.3、TaNPF8.1及TaNPF8.3; 高氮(N330)条件下上调/下调表达基因包括TaNPF2.11、TaNPF5.2、TaNPF5.10、TaNPF6.3、TaNPF8.3及TaNPF8.5; 低/高氮处理下差异表达基因在各染色体上均有分布。不同氮处理均上调或下调的基因为TaNPF2.11、TaNRT2.4、TaNPF4.4、TaNPF4.6、TaNPF6.3及TaNPF8.3, 亦分布于各染色体上。可见, TaNRT/TaNPF基因家族在染色体中分布广泛, 可能在小麦氮代谢及氮素利用效率过程中相互协同或补充, 调节机制比较复杂。

A: 组织特异表达TaNRT/TaNPF基因染色体定位; B: 氮调控差异表达TaNRT/TaNPF基因染色体定位。

A: the distribution of tissue-specific TaNRT/TaNPF gene chromosomes; B: the distribution of TaNRT/TaNPF gene regulated by nitrogen chromosomes.

2.5 TaNRT/TaNPF家族蛋白互作网络分析

利用Cytoscape对小麦表达量大且具有组织特异性的基因, 如根系特异表达的TaNRT3.1、茎秆主要表达的TaNPF4.5及花期叶片主要表达的TaNPF8.1, 构建了蛋白互作网络(图7)。与TaNRT3.1互作的蛋白有6个, 包括高亲和力硝酸转运家族TaNRT2.1/ TaNRT2.3、无机离子转运及代谢蛋白TRIU3_20504及未命名蛋白, 推测根系吸收转运NO3–需要TaNRT2等相关基因协同作用。TaNPF8.1互作蛋白有8个, 包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶、伴侣蛋白、GPI- anchored蛋白、叶绿素A–B结合蛋白、转录因子MYB44和藏花酸葡糖基转移酶, 可见NO3–在叶片中转运十分复杂, 涉及光合作用及转录因子调节网络。TaNPF4.5互作蛋白有14个, 包括转录因子、伴侣蛋白、天冬氨酸蛋白酶、花青素、糖基转移酶、烷烃羟化酶、叶绿素A-B结合蛋白和蛋白酶抑制剂。分布于根、茎和叶片的主要TaNRT/TaNPF蛋白存在直接或间接的互作关系, 且不同部位有其特殊的互作蛋白。

图7 组织特异表达的TaNRT/TaNPF的蛋白互作网络

蛋白质用节点表示, 相互作用用连线表示. 灰色: 转录因子; 黄色: 无机离子转运及代谢蛋白; 草绿色: 天冬氨酸蛋白酶; 红色: 叶绿素A-B结合蛋白; 紫色: 蛋白酶抑制剂; 绿色: 藏花酸葡糖基转移酶; 黑色: GPI-anchored蛋白; 蓝色: 花青素; 宝石蓝: 伴侣蛋白; 玫红色: 烷烃羟化酶; 浅黄色: 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶; 浅绿色: 高亲和力硝酸转运蛋白; 浅粉色: 糖基转移酶。

Proteins are represented by nodes and interactions by wires. Gray: transcription factors; Yellow: inoraganicion transport and metabolism; Prasinous: aspartic acid protease; Red: light-inducible protein; Purple: Bowman-Birk type proteinase inhibitor; Green: crocetin glucosyltransferase; Black: GPI-anchored protein; Blue: cytochrome; Sapphire: chaperone protein; Rosy: MAH1; Buff: NAD kinase; Reseda: nitric acid transporter; Indipink: Cyanidin 3-O-rutinoside 5-O-glucosyltransferase.

3 讨论

NO3–是植物生长发育的主要氮源, 亦是植物体内无机氮运输的主要形式。NO3–的吸收、运转及其同化是小麦蛋白质形成的基础, 了解NO3–的吸收、转运及同化机制是提高小麦氮素利用效率的理论基础。TaNRT/TaNPF家族基因编码膜转运蛋白, 参与NO3–吸收转运过程。小麦NO3–分配随生育时期变化, 开花前NO3–从根部运往地上部, 多储存于旗叶中; 开花后旗叶中NO3–输出速率不断升高, 并在灌浆后期达到最大, 随后降低[31]。本文研究发现, 氮高效品种ZM27花期旗叶TaNPF8.1表达量在不同氮水平下均高于氮低效品种AK58, 且N22处理达到显著水平。小麦旗叶与产量形成关系密切, 开花期旗叶NO3–积累为后期灌浆过程含氮化合物向籽粒运输提供物质基础[29]。氮高效小麦品种开花期旗叶NO3–积累多, 可能与TaNPF8.1表达量较高有关[29]。qRT- PCR结果显示, ZM27各组织中TaNPF8.1基因表达量比AK58高, 这可能是ZM27氮素高效利用原因之一。

PPI分析发现TaNPF8.1与伴侣蛋白、叶绿素A–B结合蛋白、转录因子MYB44和藏花酸葡糖基转移酶等存在互作关系。叶绿素A-B结合蛋白参与光合作用; 转录因子MYB44触发气孔关闭维持水分水平和调节ROS稳态, 应对干旱和热激联合反应[32], 推测TaNPF8.1涉及光合作用和胁迫应答机制, 但它们之间如何互作参与氮代谢过程尚需深入研究。

NO3–吸收、转运、同化及再分配过程十分复杂, 受植物内外界环境调控。植物体内外NO3–浓度通过调节NRT/NPF家族基因表达影响根系对NO3–的吸收[28]、调节各组织间硝酸盐的分配[25]。OsNPF6.5定位于水稻根部, 决定不同水稻品种硝酸盐利用效率[22]。AtNPF6.2定位于叶柄[2], 参与NO3–从根到叶的运输[33]。OsNPF7.3定位于茎和侧根, 参与氮素分配和籽粒产量[25]。TaNRT/TaNPF家族也具有组织特异性, TaNRT2.2、TaNPF6.3和TaNRT3.1主要在小麦根系中表达, TaNPF4.5主要在茎中表达, TaNPF8.1主要在旗叶中表达。依据GO数据库对DEGs进行功能分析发现TaNRT/TaNPF家族基因广泛参与小麦NO3–吸收、转运、再分配及多肽的运输等过程。结合前人研究推测TaNRT2.2、TaNPF6.3和TaNRT3.1可能影响不同氮效率小麦品种对NO3–吸收和转运。因此, 深入研究TaNRT/TaNPF家族基因功能及表达特点有利于解析氮高效的分子机制。

Okamoto等[13]研究发现, 高亲和力的硝酸盐转运体都依赖NRT3基因表达, 而低亲和力的硝酸盐转运体并不需要。拟南芥AtNRT3.1与AtNRT2互作促进AtNRT2的转运活性[13]。本研究通过PPI分析发现小麦TaNRT3.1与TaNRT2亦存在互作关系, TaNRT3.1是否促进TaNRT2的转运活性, 从而从NO3–吸收和转运方面促进小麦氮素利用还需进一步研究。

4 结论

小麦TaNRT/TaNPF基因家族存在组织器官特异性表达, 其表达水平受施氮量及品种调控。与氮低效品种AK58相比, 氮高效品种ZM27的差异基因多上调表达, TaNPF8.1在差异基因中表达量最高, TaNRT/TaNPF家族差异表达基因在各个染色体上均有分布。蛋白质互作分析显示不同组织间TaNRT/ TaNPF互作蛋白存在直接或间接关系, NO3–转运过程除需要TaNRT/TaNPF家族协同作用外, 还需转录因子MYB、叶绿素A–B结合蛋白、伴侣蛋白等共同调节。

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附表1 不同氮效率小麦品种差异基因表达量分析

Table S1 Analysis of differential gene expression in wheat cultivars with different nitrogen efficiency

类型Type基因名称Gene nameAK58 N120AK58 N225AK58 N330ZM27 N120ZM27 N225ZM27 N330 Up-regulated DEGsNPF2.3TraesCS4A03G10989000.140.290.030.690.350.50 NPF2.11TraesCS5A03G00089002.793.032.195.705.645.08 TraesCS5B03G00016002.392.122.065.866.845.24 TraesCS5B03G01028008.116.376.5211.2911.949.35 NPF4.4TraesCS4A03G05997000.280.410.360.730.751.01 NPF5.1TraesCS7A03G11199002.332.782.503.053.923.64 TraesCS7D03G10674000.500.820.560.640.791.05 NPF5.8TraesCS7B03G02658000.280.390.270.560.500.56 TraesCS7D03G04408000.601.170.911.281.371.45 NPF5.10TraesCS3A03G09038000.590.750.430.711.010.93 NPF5.13TraesCS2D03G13237000.881.191.231.111.581.93 NPF6.2TraesCS1B03G00779000.330.390.370.190.230.95 NPF7.3TraesCS6D03G05935000.210.290.160.440.370.40 NPF8.1TraesCS3A03G092290035.4437.4534.9651.5652.5253.18 TraesCS3A03G09232003.283.043.175.676.215.36 TraesCS3D03G08526000.820.770.620.720.630.96 TriticumnewGene_808717.3616.6315.8625.2825.2724.94 NPF8.3TraesCS7A03G12901000.090.130.581.020.541.13 TraesCS7B03G08353001.981.991.652.602.772.73 Down-regulated DEGsNRT2.4TraesCS7B03G08824005.314.374.390.190.090.25 NPF2.11TraesCS5D03G00109002.531.531.671.491.421.41 NPF4.6TraesCS5D03G01632002.171.201.821.290.500.44 NPF5.2TraesCS4D03G07794001.791.321.561.070.981.37 NPF5.10TraesCS2A03G13507001.892.302.510.991.331.26 TraesCS2B03G15407001.551.391.800.941.091.21 TraesCS3A03G09029000.930.830.890.520.720.64 NPF8.3TraesCS6B03G11469001.100.981.380.540.790.92 TraesCS7B03G08390001.561.532.330.240.430.56 TraesCS7B03G08392007.127.146.784.815.004.94 NPF8.5TraesCS2D03G00168002.021.591.791.081.521.51

Gene expression characteristics of TaNRT/TaNPF family in wheat cultivars with different nitrogen efficiency

WANG Lu-Lu1, YI Zi-Bo1, WANG Hao-Zhe1, NAI Fu-Rong2, MA Xin-Ming1, ZHANG Zhi-Yong1,*, and WANG Xiao-Chun1,2,*

1Co-constuction State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China;2Department of Biochemistry, College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China

Nitrogen is one of the essential elements for wheat growth and development, and NO3–-N is the main form of nitrogen that wheat obtains from soil. NRT/NPF genes family encode membrane transporters, which are mainly involved in NO3–-N absorption, transport, and allocation in plants. In order to understand the relationship between NRT/NPF family and nitrogen utilization in wheat, the relative expression characteristic of TaNRT/TaNPF family in flag leaves of N-efficient wheat cultivars Zhoumai 27 (ZM27) and N-inefficient wheat cultivars Aikang 58 (AK58) at flowering stage were studied with the second-generation sequencing technology. The results showed that 386 genes of TaNRT/TaNPF family were identified in the second generation transcriptome database. Compared with AK58, there were 27, 16, and 23 differentially expressed genes in ZM27 in reducing (N120), normal (N225), and excessive (N330) nitrogen treatments. There were 16 (59.26%), 12 (75%), and 19 (82.61%) up-regulated genes in ZM27, respectively. Seven genes were down-regulated in ZM27 in reducing nitrogen treatment. The relative expression level of TaNPF8.1 was the highest and significantly up-regulated by 1.5 times in nitrogen excessive condition. In conclusion, the relative expression of TaNRT/TaNPF family genes was regulated by nitrogen application rate and cultivar. Wheat network database showed that the relative expression of TaNRT/TaNPF family had tissue specificity and chromosomal preference. The highest expression level of TaNPF8.1 in flag leaf was located on chromosome 3A, and the root specific expression TaNRT2.2 and TaNRT3.1 were mainly distributed on chromosome 6. The stem specific expression of TaNPF4.5 was mainly distributed on chromosome 2. The qRT-PCR of TaNRT/TaNPF genes were consistent with the results of the second-generation transcriptome and network data. Interaction analysis of TaNPF8.1, TaNPF4.5, and TaNRT3.1 revealed that NO3–-N transport may also require the collaborative participation of transcription factor MYB, chlorophyll A-B binding protein, and chaperone protein. These findings laid a foundation for further studies on the relationship between TaNRT/TaNPF family expression and nitrogen uptake and utilization.

wheat; NRT/NPF; nitrogen use efficiency; different expression; tissue specificity

10.3724/SP.J.1006.2023.21063

本研究由国家自然科学基金项目(32071956)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32071956).

王小纯, E-mail: xiaochun.w@163.com; 张志勇, E-mail: zhiyongzhang@henau.edu.cn

E-mail: wanglulu9501@163.com

2022-09-13;

2023-04-17;

2023-05-16.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20230515.1731.002.html

This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).