细胞外囊泡与非编码RNA在肝缺血再灌注损伤中作用的研究进展

雷嘉豪，缪炳文，缪辉来

1.广东医科大学附属第二医院 肝胆胰外科，广东 湛江 524003；2.广东医科大学 肝损伤诊断与修复重点实验室，广东 湛江 524001

肝缺血再灌注损伤（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是肝脏手术、创伤、失血性休克和移植的常见并发症。除了影响肝脏外，HIRI还通过氧化和炎症途径导致远端器官损伤[1]。造成HIRI的因素很多，包括炎症反应、氧化应激、细胞的凋亡等[2]。目前，临床防治HIRI效果仍不理想，极大影响患者的生活质量，加重患者和医疗系统的负担，甚至危及患者生命[3]。因此，深入了解HIRI发生发展的分子生物学机制对HIRI的早期诊断和治疗具有重要意义。

细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是一种由细胞释放到细胞外基质的膜性小囊泡，广泛存在于各种体液中，如血液、尿液以及肝硬化腹水中。EVs含有蛋白质、脂质和核酸等重要物质，可通过受体-配体结合激活信号通路或内吞、吞噬或膜融合的方式将这些物质传递到受体或靶细胞，调节受体细胞表型，在细胞间的通信中发挥关键作用[4]。非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）指不编码蛋白质的RNA，但通过多种途径参与基因的转录与转录后的修饰过程，从而影响细胞的生物学行为[5]。越来越多证据表明，一些ncRNA包括微小RNA（microRNA，miRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在调节HIRI中起着重要作用。EVs作为细胞间通讯的载体，可运输ncRNA进入受体细胞，影响自噬、细胞增殖、凋亡、氧化应激、炎症反应等病理生理过程，从而对HIRI产生影响。本文对EVs、ncRNA以及EVs-ncRNA对HIRI调节作用进行总结，并展望EVs携带的ncRNA在临床应用中对HIRI具有早期诊断和治疗的潜力。

1 EVs在HIRI中的作用

研究表明，细胞可以分泌多种不同类型的EVs，且每类EVs都具有独特的生物发生机制，存在特征性蛋白质和核酸。根据生物起源，EVs可分为3类：外泌体（exosomes）、微囊泡（microvesicles，MVs）和凋亡小体（apoptotic bodies）[6]。外泌体最大径30～100 nm，开始于胞内小体进一步向内膜突起形成的管腔内囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），ILVs进一步成熟为多囊泡体（multivesicular body，MVB），分泌型MVB与细胞质膜融合，释放出外泌体[7]。MVs最大径100～1 000 nm，是由细胞质膜向外出芽，与细胞膜融合后直接脱落形成。凋亡小体最大径2～5 μm，伴随细胞凋亡而产生[8]。

大量研究发现EVs可以通过增强自噬、抑制氧化应激、炎症反应，减少肝细胞凋亡来减轻HIRI。Yang等[9]发现骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞分泌的外泌体通过增强自噬可有效减轻肝细胞凋亡，减轻HIRI。Yao等[10]在人脐带间充质干细胞的EVs中发现了一种位于线粒体中的抗氧化酶-锰超氧化物歧化酶（Mn superoxide dismutase，Mn SOD），Mn SOD可以抑制氧化应激和中性粒细胞炎症反应，并在体内外抑制肝细胞凋亡，因此，通过EVs传递，可以保护肝组织免受IRI的影响。Haga等[11]发现间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）来源的EVs增加了肝脏中NACHT，LRR and PYD结构域蛋白12和趋化因子配体1的mRNA表达并减少了IRI期间炎症细胞因子（如IL-6）的mRNA表达来调节炎症反应减轻肝脏损伤，从而改善HIRI。Nong等[12]研究表明人诱导多能干细胞来源的间充质干细胞外泌体可以通过抑制炎症细胞的浸润、减少炎症因子的释放、减轻氧化应激，进而降低肝损伤程度和减少肝细胞坏死和凋亡，改善HIRI。以上研究说明EVs可通过多种途径来减轻HIRI，在HIRI修复中起着至关重要的作用。

2 ncRNA在HIRI中的作用

ncRNA可以根据其大小分为不同的类别，包括miRNA、lncRNA、环状RNA（circular RNA，circRNA）、tRNA衍生的小RNA（tRNA derived small RNA，tsRNA）和piRNA等[13]。非编码核酸序列（不编码蛋白质）约占人类基因组的98%[14]。近年来，大量的研究证明lncRNA和miRNA的表达水平对HIRI的发生发展起关键作用[15]。

2.1 miRNA在HIRI中的作用

miRNA是一类由内源基因编码的长度约为21～25个核苷酸组成的非编码单链RNA分子，通过与靶标mRNA的3’端非翻译区（3’-untranslated region，3’-UTR）特异性结合，从而引起靶标信使RNA（mRNA）分子的降解或翻译抑制，参与转录后基因表达调控[16]。已有研究证实miRNA异常表达与HIRI密切相关。

自噬主要起到促进细胞存活的作用，以应对营养缺乏和缺氧，然而，受损细胞内过多的自噬可反过来诱导细胞死亡[17]。其中有的miRNA通过抑制自噬来减轻HIRI。Li等[17]发现miR-30b过表达可降低自噬相关基因12（autophagy-related gene 12，Atg12）的表达，使Atg12-Atg5 结合蛋白水平下降，从而抑制自噬来提高IR诱导的肝细胞的存活率以减轻HIRI。有的miRNA则是通过上调自噬来加重HIRI。Li等[18]发现 miR-17通过抑制Stat3的表达上调自噬来加重HIRI。miRNA还可以通过减轻炎症反应和氧化应激、减少细胞凋亡来减轻HIRI。Ji等[19]发现七氟烷通过下调miR-218-5p的表达水平，促进GAB2 蛋白表达，随后激活PI3K/AKT通路。这最终导致细胞凋亡、氧化应激和炎症反应的减少，从而减轻HIRI。Wang等[20]发现异氟醚通过抑制包含3B的Ⅲ型纤维连接蛋白结构域表达，上调了miR-9-3p，减轻了大鼠炎症、氧化应激、肝组织细胞凋亡，从而保护HIRI。Zheng等[21]发现miR-34a-5p可能通过下调肝细胞核因子4α来抑制JNK/P38信号通路，降低凋亡蛋白的表达，从而有效减轻肝细胞的氧化应激损伤，保护肝脏免受I/R损伤。Luo等[22]发现miR-194 的过表达降低了PHLDA1，而PHLDA1的炎症信号转导是通过激活TNF受体相关因子6（TRAF6）。TRAF6 是肝脏IRI中多种炎症信号的汇合，加重了肝脏IRI的应激和炎症，通过miR-194来抑制PHLDA1可改善肝IRI中炎症水平，减轻肝IRI。还有些miRNA会加重炎症，促进细胞凋亡来加重HIRI。Huang等[23]发现miR-450b-5p通过抑制α B-晶体蛋白（B-crystallin，CRYAB），而CRYAB通过阻止抑制性κB激酶（inhibitory κB kinase，IKK）的激活，减少NF-κB诱导的炎症反应，CRYAB减少导致HIRI加重。Pan等[24]发现miR-191 过表达会抑制ZO-1 相关Y-box因子（ZONAB）促进G0/G1细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡，从而加重HIRI。Li等[25]发现在肝缺血再灌注状态下miR-142-3p表达下调表达水平降低，miR-142-3p靶向MARCKS以调节其表达，MARCKS激活p38/JNK信号，上调NF-κB表达以加速炎症，抑制PI3K/AKT信号以促进细胞凋亡，加重HIRI。因此得出结论：miRNA可通过不同作用机制调节HIRI，其中有的减轻HIRI，有的会加重HIRI。

2.2 lncRNA在HIRI中的作用

lncRNA是200 多个核苷酸的转录本，占所有ncRNA的80%～90%[26]。随着研究的不断深入，人们发现lncRNA广泛参与人体的各种生理和病理过程。大多数lncRNA位于细胞核内，参与转录调节或mRNA降解。位于细胞质中的剩余lncRNA主要参与转录后调节，充当miRNA“海绵”负调节miRNA，或充当竞争性内源性RNA（ceRNA）在转录后水平调节基因表达[27]。研究表明lncRNA已被确定为多种生物过程的关键调节因子，其异常表达与多种疾病的生理和病理生理有关，包括肝损伤[28]。

Tang等[29]研究发现miR-20b-5p通过靶向自噬相关基因7（autophagy-related gene 7，ATG7）并抑制肝细胞自噬。lnc HOTAIR作为可以作为miR-20b-5p的竞争内源性RNA减弱其对ATG7 的抑制作用，从而增强自噬，加重HIRI。Wang等[28]研究表明lnc-NEAT1增加了缺血再灌注中肝细胞中炎性因子的水平，包括IL-1β、IL-6和TNF-α，加重炎症并诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖，加重HIRI。Ying等[30]发现lncRNA Gm4419 通过调节miR-455/SOX6 通路，诱导HIRI中的细胞凋亡，加重HIRI。Dai等[31]研究发现lncRNA AK054386在肝IR体内模型和体外模型中作为miR-199的竞争性内源性RNA导致IRI小鼠和细胞模型中持续的内质网应激（ERS）和细胞凋亡，加重HIRI。Zhang等[32]发现lncRNA MALAT1通过调节HMGB1-TLR4通路抑制凋亡和炎症，减轻HIRI。以上研究表明lncRNA既可通过增强自噬、加重炎症、促进细胞凋亡以及抑制细胞增殖加重HIRI，也可以通过抑制细胞凋亡和炎症来减轻HIRI。

3 EVs-ncRNA在HIRI中的作用

随着高通量测序技术的发展，EVs中包含的ncRNA已被确认，包括miRNA、circRNA，以及lncRNA等。EVs的脂质双分子层可以保护ncRNA在转运过程中免受核糖核酸酶降解，保证其生物学活性[33]。一旦EVs-ncRNA脱离降解途径并被传递给受体细胞，它们就可以引发相应的功能反应。

铁死亡是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式。Li等[34]发现血红素加氧酶-1 修饰的骨髓间充质干细胞的外泌体通过miR-29a-3p靶向脂肪肝细胞中铁反应元件结合蛋白2（iron response element-binding protein 2，Ireb2），下调Ireb2的表达，通过抑制铁死亡从而减轻大鼠HIRI。Xie等[35]研究表明来自人脐血间充质干细胞的外泌体通过miR-1246靶向IL-6加速了抗炎调节性T（regulatory T，Treg）细胞的分化并抑制了促炎性T辅助因子17（T helper 17，Th17）细胞的分化，调节Th17/Treg细胞平衡从而改善HIRI。此外还发现人脐血间充质干细胞来源的外泌体miR-1246通过靶向糖原合成酶激酶3β激活Wnt/β-catenin信号通路，激活的Wnt信号有助于β-连环蛋白在细胞核内积累从而产生抗炎、抗凋亡、抗氧化应激的能力，以此来缓解HIRI[36]。Liu等[37]研究表明肝细胞来源的外泌体miR-122-5p通过下调PPARδ和激活NF-κB通路使Kupffer细胞极化，从而介导HIRI。抑制miR-122-5p对HIRI具有保护作用。以上说明EVs可以通过传递ncRNA来介导HIRI。

综上所述，多种干细胞来源的EVs、ncRNA在调节HIRI上都起着至关重要的作用，而EVs作为ncRNA的载体，可以通过EVs传递ncRNA来发挥作用，这为临床上早期诊断和治疗HIRI提供了新的思路。

4 展望

本综述较为全面的概述了EVs、ncRNA以及EVs来源的ncRNA在调节HIRI中的作用，其中包括调节HIRI中自噬、炎症、氧化应激、凋亡等病理反应。实验证据表明，EVs来源的保护性非编码RNA具有治疗潜力，尤其是从干细胞中释放出来的ncRNA，可用于治疗HIRI。在HIRI中，EVs来源的ncRNA是一种十分具有吸引力的新型治疗方法，具有改善HIRI的潜力，值得进一步研究。同时EVs来源的ncRNA也可作为HIRI的生物标志物，从而实现对HIRI的早期诊断。尽管这种技术有很好的应用前景，但关于EVs-ncRNAs还有许多问题尚未解决，存在许多挑战。比如EVs-ncRNAs介导的多种生物效应背后的原因尚不完全清楚，需要进一步研究。circRNA作为ncRNA的一种，它在HIRI中的作用尚不明确，有待进一步研究。并且，基于EVs的疗法在转化为人类医学之前还需要更多的临床前研究，以及EVs的临床应用面临着生产、分离、纯化、储存以及将如何将EVs精准递送到靶细胞等问题。随着研究的深入和方法学创新，这些问题将会逐步得到解决。