花期和果期遍地金的镇痛及抑菌作用比较研究

杨 巍,李荣权

(1.农安县万顺乡综合服务中心,吉林 农安130231; 2.吉林农业科技学院动物科技学院,吉林 吉林 132101)

中草药遍地金是金丝桃属植物,花、叶、茎、根等均可以入药,又被称为小化血、小化药、蚂蚁草、小黄花香等[1],主要含有环丙酮类、脂肪酸类、甾体类化合物等几十种成分[2]。遍地金在我国被发现且使用较早,主要用于治疗炎症、腹泻等疾病,有清热解毒的功效。现代药理学研究发现,遍地金具有多种药理活性,具有抗抑郁[3]、抗肿瘤、抑制中枢神经、创伤收敛作用及抗菌消炎与镇痛效果,是一种副作用小、不良反应少的中药[4]。目前,对遍地金镇痛抗菌的相关研究较少,尚未明确其有效的化学成分。本研究对遍地金花期与果期的镇痛抑菌效果进行比较,为其药理作用及有效化学成分研究奠定基础。

1 试验材料

1.1 药材与试验动物

花期遍地金于7月采摘,产地云南;果期遍地金于10月采摘,产地云南。试验小白鼠96只,18～20 g,雌性,购自长春市土门岭诚信动物饲养场。

1.2 菌种及试剂

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、冰醋酸溶液、生理盐水(农安县畜牧业管理局提供),阿司匹林(上海信谊天平药业有限公司生产),琼脂培养基(购自南通凯恒生物科技发展有限公司)。

1.3 仪器设备

大小鼠热板测痛仪(ZL-020,安徽耀坤生物科技有限公司生产),电子天平(EL600,日本岛津集团生产),高压灭菌锅(BKQ,上海申安生产),恒温培养箱(303-00(A),康恒仪器生产),无菌超净台(BBS-DSC,博科集团生产)。

2 试验方法

2.1 遍地金水提液的制备

取花期遍地金与果期遍地金各200 g,分别用10倍量的水浸泡1 h,放入锅中煎煮3次,每次50 min,合并3次煎煮液进行浓缩,浓缩至100 mL、浓度2 g·mL-1,用纯化水进行稀释,配制高、中、低3个浓度,分别为2.0、1.0、0.5 g·mL-1,冰箱冷藏,备用。

2.2 镇痛试验

2.2.1 分组及给药

取48只小白鼠,随机分为8组,每组6只小白鼠,分别为对照组,阳性对照组(阿司匹林组),花期遍地金低、中、高剂量组,果期遍地金低、中、高剂量组。阿司匹林0.2 mL/10 g(4 mg/mL)。花期遍地金低浓度组、中浓度组、高浓度组,规格均为0.2 mL/10 g,浓度分别为0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL,对照组灌胃等量生理盐水,果期遍地金高中低浓度组与花期遍地金组同。

2.2.2 扭体法试验

各组小白鼠按分组、体重进行药物灌胃,1次/d,连续灌胃5 d,最后一次给药40 min后分别给各组小白鼠腹腔注射0.6%冰醋酸,0.2 mL/只,观察并记录15 min内各组小鼠扭体次数均值,用以下公式计算镇痛百分率[5]。

镇痛百分率=(对照组扭体次数均值-实验组扭体次数均值)/对照组扭体次数均值×100%

2.2.3 热板法试验

为了确保试验的准确性,每只小白鼠测定2次,测定时间间隔为7 min,取2次痛阈值的平均值。痛阈值平均值为10～30 s的小白鼠为试验所需动物,选取合格的小鼠48只,分组方法同2.2.1。将各组小鼠分别放在温度为(55±0.5) ℃的热板上,计算小鼠足底接触热板时间至其舔足的时间,该时间段为小鼠的痛阈值,记录数据。连续7 d在相同时间段给小鼠灌胃,在最后一次给药后分别在60、90、150 min对其痛阀值进行测定,对所得数据进行记录,计算痛阀提高百分率,对组间差异进行比较。

痛阀提高百分率=(每只小鼠用药后不同时点的痛阀-该只小鼠用药前痛阀均值)/该只小鼠用药前痛阀均值×100%

2.3 体外抑菌试验

2.3.1 最小抑菌浓度(MIC)测定

取8支灭菌试管,依次编号,向各个试管中分别加1 mL液体培养基。在无菌操作下用移液管吸取1 mL花期水提液原液(2 g/mL),将其加入到第1支试管中,混合均匀后吸取1 mL混合溶液加入到第2支无菌试管中,按照此倍比依次稀释至第7支试管,再混匀,从第7支试管中取出1 mL混合液体弃掉,此时试管中药液浓度依次为原药液浓度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128,第8支试管为对照组管,不加任何药液。使用灭菌的移液管移取菌液0.05 mL,依次加到8支试管中混合均匀,8支试管置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后进行观察[6]。未发现细菌生长的试管的药液浓度即为该供试菌的最小抑菌浓度。果期MIC测定同花期。

2.3.2 纸片法抑菌试验

分别将直径为6 mm的灭菌纸片浸泡在花期遍地金2 g/mL、1 g/mL、0.5 g/mL,果期遍地金2 g/mL、1 g/mL、0.5 g/mL,无菌水(空白对照组)中,充分浸泡20 min即可用于试验。

用无菌吊环吊取大肠杆菌,放入无菌水中制成大肠杆菌液,用移液器分别吸取1 mL大肠杆菌液,放入培养皿中,再用涂布器涂均匀,将同一浓度的花期、果期遍地金药敏片放入同一个平板内,再加入一个空白纸片作对照,每个浓度3个平板,纸片放置后置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h,测量抑菌圈直径。抑菌圈直径小于10 mm为耐药,10～15 mm为中度敏感,大于15 mm为高度敏感。

金黄色葡萄球菌的抑菌试验操作同上。

3 结果与分析

3.1 镇痛试验

3.1.1 冰醋酸扭体试验

由表1可知,对照组的扭体次数>果期遍地金的扭体次数>花期遍地金的扭体次数>阳性对照组的扭体次数,花期、果期遍地近随着浓度的增加,扭体数均值逐渐减少,镇痛百分率逐渐增大,说明镇痛效果与花期、果期遍地金浓度呈正比。相同浓度低浓度与中浓度镇痛效果无显著差异(P>0.05),而高浓度的果期与花期则差异极显著(P<0.01)。各药物组与阳性对照比较,差异极显著(P<0.01)。

表1 花期与果期遍地金对冰醋酸致小鼠扭体反应的影响

3.1.2 热板试验

热板法试验结果如表2所示,在给药后60 min、90 min、120 min,低浓度花期与果期遍地金组及对照组痛阈值比较差异不显著(P>0.05),中浓度时花期极显著(P<0.01),果期不显著(P>0.05),高浓度时两者都显著,从中可以看出,花期遍地金的镇痛效果比果期好。通过计算可知,中、高浓度时,果期遍地金与花期遍地金的效果差异显著。由痛阈值提高率可知,从给药后60 min到给药后120 min,花期与果期遍地金痛阈值提高率都在不断增加,给药90 min后也未达到药效最高点。由试验结果可知,花期遍地金镇痛效果稍强。

表2 热板法镇痛试验结果

3.2 体外抑菌试验

3.2.1 MIC值测定结果与分析

由表3可知,花期与果期遍地金对大肠杆菌的MIC值分别是25、12.5,对金葡菌的MIC值为12.5、5.25,说明果期遍地金的抑菌效果好于花期,初步判定果期遍地金比花期遍地金敏感。

表3 花期和果期遍地金MIC值

3.2.2 纸片法测定结果与分析

由表4可知,与空白组比较,1 g/mL、2 g/mL花期与果期遍地金对大肠杆菌(金黄色葡萄球菌)抑菌圈直径差异显著性(P<0.01)。同等浓度遍地金对金黄色葡萄球菌的抑制效果更好,2 g/mL果期遍地金对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的平均抑菌圈直径都大于10 mm,花期直径都小于10 mm,由此可知,果期遍地金组的抑菌效果更具研究价值。

表4 花期和果期遍地金抑菌圈直径

4 讨论

目前对于遍地金的研究主要集中在抗抑郁、抗肿瘤的作用及机理上,对于镇痛、抗炎的研究相对较少,本研究得出不同浓度花期、果期的提取液对大肠杆菌及金葡菌均有不同的抑菌效果,这与Bala-periasamy B 等的研究结果一致[7],对革兰氏阳性菌的抗菌活性高于革兰氏阴性菌,更高浓度是否会有更大的抑菌作用仍需不断探讨。对于遍地金的镇痛作用未见有报道,提取方法等是否会影响作用的强弱有待于进一步研究。遍地金的化学成分随着研究的不断深入,多种新的化合物将不断被发现,遍地金的药用功能将会有更大的研发空间,饲料添加剂的开发将具有广阔的前景。

5 结论

本实验对花期与果期遍地金的镇痛及抑菌作用进行比较。扭体法实验结果(抑制率花期低、中、高为5.69%、16.88%、35.56%,果期低、中、高为10.45%、11.24%、19.63%)与热板实验结果均显示花期遍地金的镇痛效果比果期更好,其中高浓度两个时期遍地金给药后痛阈值差异极显著。用二倍稀释法分别测定了花期与果期遍地金的MIC值(大肠杆菌为25 μg·mL-1、12.50 μg·mL-1,金黄色葡萄球菌为12.5 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1),了解其对两种菌的不同敏感程度。体外抑菌实验表明,花期遍地金对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌敏感度都不强,抑菌效果不强,高浓度时抑菌圈相对较大,对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的平均抑菌圈直径分别为8.13 mm、7.98 mm。果期遍地金抑菌效果相对更好一点(属于中度敏感),高浓度的平均抑菌圈直径值分别为11.95 mm、10.83 mm。花期遍地金在镇痛方面利用价值更高,如果用遍地金来抑菌可选择果期遍地金。此结果可为遍地金的合理利用及其镇痛、抑菌作用研究提供参考。