丁香和瑞香狼毒提取物对苦瓜枯萎病菌抑菌机理初探

赵艳芳，胡春艳，曹挥

（山西农业大学 植物保护学院，山西 太谷 030801）

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）为无性态菌门丝孢纲镰刀菌属，由该菌引起的植物枯萎病是一种世界性土传病害[1-2]。此类病原菌以兼性寄生为主，寄主范围广泛[3]，可引起瓜类、茄科、豆科等100多种植物枯萎病的发生，致作物在2～3 a内大面积感染枯萎病[4]。被其所侵染的植物通常出现多器官及组织的腐烂，如根腐、花腐及穗腐等，严重危害作物的产量和品质[5]。目前，植物枯萎病主要通过多菌灵等化学农药进行防治[6]，但是长期大量使用化学农药对环境造成了严重的污染[7]。因此，寻找及研发替代化学农药的高效绿色产品成为近年来学者的研究热点[8]，植物源农药因其具有对生态友好、可生物降解性、作用方式多样等特点备受人们关注[9-10]。

丁子香（Syzygium aromaticum）又称丁香，为桃金娘科蒲桃属植物，在我国云南、海南等地多有种植，资源丰富[11]。研究表明，丁香提取物中主要的活性成分是丁子香酚[12]，丁香酚具有广谱抗菌性，对金葡萄球菌等食源性病原菌[13]、禾谷镰刀菌等植物病原真菌均有抑制作用[14]。瑞香狼毒（Stellera chamaejasme）又称西北狼毒、断肠草等，为瑞香科狼毒属植物，其主要分布在我国的西北、西南、东北等地区。研究表明，瑞香狼毒在抑菌、消炎、祛痰、抗病毒、杀螨虫、抗癌等方面有良好的生物活性，其主要化学成分包括香豆素类、黄酮类、萜类等六大类化合物[15]，在杀虫、抗病毒等方面有特殊功效[16]。研究发现，瑞香狼毒根中香豆素的含量较高，具有良好的消炎、抑菌等作用[17]。

苦瓜以其清热解凉、滋阴壮阳、降低血糖等独特的药理作用[18]，深受人们喜爱。苦瓜枯萎病的发生严重影响了其产量与质量，目前市场上销售的对西瓜、香蕉和甜瓜等枯萎病具有良好防治效果的农药及微生物制剂对苦瓜枯萎病的防治效果不是很理想[19]，因此，研究一种安全有效的防治苦瓜枯萎病措施十分必要。

本试验采用菌丝生长速率法，测定了丁香、八角、芫花、瑞香狼毒、羌活、结香等6种植物乙醇提取物对苦瓜枯萎病菌的抑菌效果，从中挑选出对苦瓜枯萎病抑制效果最好的丁香和瑞香狼毒2种植物提取物，并对其抑菌机制进行了初探，旨在为进一步开发植物源农药提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植物材料 丁香、瑞香狼毒、羌活、芫花、八角和结香等植物材料的信息如表1所示。

表1 供试植物材料名称及组织Tab.1 Name and tissue of the plant materials for testing

1.1.2 供试菌种 苦瓜（尖孢镰刀菌苦瓜专化型）枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.momordicae），由河南农业大学文才艺教授提供。

1.1.3 主要仪器 气引式粉碎机（佑崎有限公司），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），光照培养箱（浙江托普仪器有限公司），紫外分光光度计（岛津有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 植物提取物的制备 将丁香、瑞香狼毒等各种植物材料磨成粉状，将其与95%乙醇体积比为1∶2混合放置72 h进行初步浸提，后在30 ℃条件下进行30 min的超声波振荡提取，将浸提物放入真空抽滤装置中进行抽滤，收集到的液体即为植物的初提物，将抽滤出的固体物质再次与乙醇混合，重复以上步骤4次，提取液使用旋转蒸发仪进行浓缩，并测定浓缩后提取液的提取率及质量浓度，每种提取物进行6次重复（表2）。

表2 供试植物提取物的提取率及质量浓度Tab.2 Extraction rate and concentration of the plant extracts for testing

1.2.2 6种植物提取物对苦瓜枯萎病菌的室内毒力测定 采用菌丝生长速率法，测定丁香、瑞香狼毒、八角等6种植物提取物对苦瓜枯萎病菌的抑菌活性，将药剂（无菌水稀释）与培养基混合配制成4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL质量浓度的药板，以加入等体积无菌水的培养基为空白对照。每个处理重复5次。用0.7 cm的打孔器在培养6 d的目的菌株培养基上取菌饼，放在药板中央，在28 ℃霉菌培养箱中培养，每隔24 h采用十字交叉法测定菌丝生长直径，利用Excel软件计算抑菌率、用SPSS 27.0软件进行毒力分析。

1.2.3 3种植物提取物对苦瓜枯萎病菌孢子萌发的影响测定 将苦瓜枯萎病菌于PDB培养基中28 ℃恒温、150 r/min的摇床中振荡培养3 d，菌液用2层灭菌纱布滤去菌丝，滤液于室温下以4 500 r/min离心20 min，去上清液，制成1.0×106个/mL的孢子悬浮液备用。将孢子悬浮液与药剂混合至药物终质量浓度分别为4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL，滴于载玻片中在28 ℃培养箱中进行保湿培养，当空白对照萌发率高于85%时记录孢子萌发数量，并进行计算。

1.2.4 丁香、瑞香狼毒提取物对苦瓜枯萎病菌酶活性测定 在无菌操作台中，将丁香、瑞香狼毒提取物加入PDB培养基中，其中，丁香提取物的终质量浓度为1 mg/mL，瑞香狼毒提取物的终质量浓度为2 mg/mL，每25 mL接入一个苦瓜枯萎病菌菌饼，摇床设置为180 r/min，28 ℃，分别在培养24、48、72、96 h时取样，常温条件下8 000 r/min离心10 min，分别收集菌丝体和菌液，放入-20 ℃冰箱中保存待测。丙二醛（MDA）、丙酮酸（PA）和几丁质酶（CHT）使用北京Solarbio试剂盒（货号分别为BC0020、BC2200、BC0825）进行测定，可溶性蛋白（Pr）的测定参考张志良等[20]的方法进行，测定菌体和菌液中的MDA、PA、Pr含量，测定菌体中的CHT活性。

1.3 数据分析

利用Microsoft Excel和SPSS 27.0软件进行数据统计和差异显著性分析，采用LSD法进行差异性显著检验（P＜0.5）。

2 结果与分析

2.1 6种植物提取物对苦瓜枯萎病菌的抑制效果

6种植物提取物在4.0 mg/mL时对苦瓜枯萎病菌的抑制效果如表3所示，所有的植物提取物对苦瓜枯萎病菌都有一定的抑制效果，丁香、瑞香狼毒、八角和结香提取物在质量浓度为4.0 mg/mL时对苦瓜枯萎病菌的抑制率均达到了100%，羌活和芫花的抑制效果较差，但其抑菌率也大于50%。

表3 6种植物提取物4.0 mg/mL时对苦瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制效果（120 h）Tab.3 Inhibition effect of 6 plant extracts at 4.0 mg/mL on the mycelial growth of Fusarium oxysporum f.sp. momordicae（120 h）

图1为不同植物提取物在不同质量浓度下对苦瓜枯萎病菌菌落的抑制效果图。由图1可知，随着植物提取物质量浓度的降低，其抑制效果也逐渐下降。丁香提取物的抑制效果最好，其质量浓度为4.0、2.0 mg/mL时，对苦瓜枯萎病菌的抑制效果均达到了100%；瑞香狼毒提取物次之，质量浓度为2.0 mg/mL时，抑菌率达到了87.02%；在质量浓度为0.125 mg/mL时，二者的抑菌率也在25%以上。八角和结香提取物在高质量浓度时抑制效果较好，但在低质量浓度时抑制效果较差，在质量浓度为0.125 mg/mL时，抑菌率均在10%以下。

2.2 6种植物提取物对苦瓜枯萎病菌的毒力

由表4可知，丁香提取物对苦瓜枯萎病菌的抑制效果最好，EC50值为0.256 5 mg/mL；瑞香狼毒提取物效果次之，其EC50值为0.354 8 mg/mL；羌活和芫花提取物的抑制效果较差，其EC50值分别为1.885 5、2.378 0 mg/mL。

2.3 3种植物提取物对苦瓜枯萎病菌分生孢子萌发的影响

由表5可知，丁香、瑞香狼毒和结香3种植物提取物处理后对苦瓜枯萎病菌分生孢子的萌发都有一定的抑制作用；在质量浓度为4.0 mg/mL时，3种植物提取物的孢子萌发抑制率均达到了80%以上，其中，瑞香狼毒提取物的抑制效果最好，丁香提取物次之。

2.4 丁香、瑞香狼毒提取物处理后苦瓜枯萎病菌中MDA含量变化

从图2可以看出，经过2种植物提取物处理后，苦瓜枯萎病菌菌丝中的MDA含量在各个时期都显著高于CK（P＜0.05），在24 h时，丁香和瑞香狼毒提取物处理组菌丝中的MDA含量均是CK处理组的2倍以上；MDA的含量随着时间的增加呈现降低的趋势；菌液中的MDA含量处理组也均高于CK组，但整体差异没有菌丝中的明显，在24 h时，瑞香狼毒处理组菌液中的MDA含量较CK提高了2.5倍，丁香和瑞香狼毒提取物处理后，MDA含量均显著升高（P＜0.05），说明二者通过破坏病菌的膜脂来影响其正常生长。

图2 不同时期不同处理苦瓜枯萎病菌中的MDA含量Fig.2 MDA contents of F. oxysporum f. sp. momordicae with different treatments at different time

2.5 丁香、瑞香狼毒提取物处理后苦瓜枯萎病菌中PA含量变化

从图3可以看出，丁香和瑞香狼毒提取物处理后的PA含量在各个时期与CK组相比，均有显著差异（P＜0.05）。在48 h时，对照组和处理组中菌丝和菌液的PA含量差异最为显著，对照组的PA含量均是处理组的1.5倍以上，处理组中PA含量整体上呈现先升高后降低的趋势，而CK组的PA含量较为稳定。丁香和瑞香狼毒提取物处理后，PA大量累积，意味着菌体内反应大部分停留在糖酵解途径，病原菌代谢发生了紊乱。

图3 不同时期不同处理苦瓜枯萎病菌中的丙酮酸含量Fig.3 Pyruvic acid contents of F. oxysporum f. sp. momordicae with different treatments at different time

2.6 丁香、瑞香狼毒提取物处理后苦瓜枯萎病菌中Pr含量变化

由图4可知，经丁香和瑞香狼毒提取物处理后，菌丝中的Pr含量均显著低于CK组，在24 h时，瑞香狼毒提取物处理后Pr含量差异最为显著（P＜0.05），较CK组降低了72%；丁香提取物处理组在48 h时与CK组相比差异最显著（P＜0.05），降低了59%。而处理组菌液中Pr含量均显著高于CK组（P＜0.05），瑞香狼毒提取物处理组在处理初期与CK组差异最显著（P＜0.05），是CK组的3倍以上；丁香提取物处理组在48 h时差异最显著（P＜0.05），随着时间的增长，处理组中Pr含量呈现降低的趋势。综上可以得出，经过植物提取物处理后，病原菌中的Pr外渗，说明二者均对病原菌的细胞膜有影响，通过破坏细胞膜的结构从而影响病原菌的生长。

图4 不同时期不同处理苦瓜枯萎病菌中的可溶性蛋白含量Fig.4 Soluble protein contents of F. oxysporum f. sp. momordicae with different treatments at different time

2.7 丁香、瑞香狼毒提取物处理后苦瓜枯萎病菌中CHT活性变化

由图5可知，丁香和瑞香狼毒提取物处理后的CHT活性均显著低于CK组（P＜0.05），随着时间的推移，丁香提取物处理后的CHT含量呈现先降低后升高的趋势，瑞香狼毒提取物处理后的CHT含量呈现降低的趋势。在72 h时，丁香和瑞香狼毒提取物处理后的CHT活性与CK相比差异最显著（P＜0.05），分别较CK降低了56%、34%。丁香和瑞香狼毒提取物均可通过影响病原菌CHT的活性来破坏病原菌的细胞壁，以干扰病原菌的正常生长。

图5 不同时期不同处理苦瓜枯萎病菌中的几丁质酶活性Fig.5 Chitirase activity of F. oxysporum f. sp. momordicae with different treatments at different time

3 结论与讨论

在过去半个多世纪，化学农药的滥用使得自然平衡被破坏，药剂的残留问题也慢慢地浮出水面[21]。目前，在全球倡导“绿色农业”的形势下，天然来源的植物源杀菌剂在实践中发挥了重要作用。植物源农药是由植物的天然化学成分或生长过程中产生的代谢产物加工而成，主要通过抑制呼吸代谢、破坏细胞结构、影响核酸及蛋白合成等方面达到抑菌的效果，从而达到环保、高效、低毒害、低残留等良好的防治效果[22]。

丁香为常绿乔木，高达10 m，原产于印尼马鲁古群岛，公元前3世纪作为“香药”传入我国。丁香的主要活性成分为丁香酚[23]，具有较强的抗真菌、防霉活性，可作为冬季水果储藏的天然抗真菌剂[24]，许多研究表明，其对高粱叶斑病[25]、小麦根腐病[26]、三七根腐病菌[27]、番茄疫霉根腐病菌[28]、番茄灰霉病菌[29]等病原菌均有较强的抑制效果。在本试验中，丁香对苦瓜枯萎病菌的抑制效果良好，在质量浓度为4.0、2.0 mg/mL时，抑菌率均达到了100%；在质量浓度为4.0 mg/mL时，孢子萌发抑制率达到了87.15%。葛达娥等[30]研究表明，不同浓度的丁香酚对链格孢霉的菌丝生长和孢子萌发都有抑制作用，并呈现一定的剂量效应。王江来[31]研究表明，丁香精油可以抑制茄腐镰刀菌孢子萌发及菌落生长。陈吼等[32]研究发现，丁香挥发油对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、青霉菌均有抑制作用。魏倩倩等[33]研究发现，丁香乙醇提取物对番茄枯萎病菌有良好的抑制作用。这与本试验的研究结果一致。

瑞香狼毒分布于东北及河北、内蒙古、甘肃、青海、宁夏、西藏等省（自治区）。其主要成分是黄酮类物质[34]，对茄子枯萎病菌[35]、番茄枯萎病菌[33]、西瓜枯萎病菌[36]、草莓灰霉病菌[37]等病原菌有较好的抑制效果。在本试验中，瑞香狼毒对苦瓜枯萎病菌的抑制效果仅次于丁香，质量浓度为4.0 mg/mL时，抑菌率为100%，质量浓度为2.0 mg/mL，抑菌率也达到了87.02%。梁海英等[38]研究表明，瑞香狼毒对稻瘟病菌的菌丝生长和孢子萌发有较强的抑制作用。郑瑞瑞[36]研究发现，瑞香狼毒对西瓜枯萎病菌有良好的抑制效果。陈云坤等[35]研究发现，瑞香狼毒对茄子枯萎病、黄瓜枯萎病、番茄枯萎病、辣椒枯萎病、草莓红中柱病、黄瓜靶斑病、黄瓜炭疽病均有较强的抑制作用。这与本试验的研究结果一致。

本试验测定了丁香和瑞香狼毒对苦瓜枯萎病菌酶活性的影响，结果表明，二者对MDA、PA、Pr含量和CHT活性均有影响，丁香和瑞香狼毒提取物处理后，MDA、PA含量均显著升高，菌丝中Pr含量降低，菌液中Pr含量显著提高，CHT活性则显著降低。黄晓芳等[39]研究表明，丁香提取物的主要成分丁香酚可以提高植物体内水杨酸含量，而适宜浓度的水杨酸可以降低花生叶片膜损伤程度[40]，酚类物质可以和细胞中的蛋白质发生化学反应，低浓度时会造成细胞变性，高浓度时蛋白质发生凝固。赵慧琳等[41]研究表明，瑞香狼毒可以显著降低番茄植株的MDA含量，与本试验的结果相一致。丁香、瑞香狼毒提取物处理苦瓜枯萎病菌后均可破坏病原菌的膜脂结构以及细胞壁结构，造成菌体内Pr外渗，从而影响病原菌的正常生长，同时也会对病原菌的代谢途径造成破坏，使其停留在糖酵解途径。但其具体抑菌机制仍需进一步探索。

本研究表明，丁香、瑞香狼毒提取物对苦瓜枯萎病菌抑制效果良好，均有潜力作为防治苦瓜枯萎病的植物源农药，研究结果为进一步开发植物源农药和枯萎病的防治提供了理论依据。