基于网络药理学探讨消瘤藤治疗子宫肌瘤的作用机制*

胡筱希，黄建猷,2，黄周锋，陆国寿,2，谭 晓，刘 瑛,2，黎 骊

（1.广西壮族自治区中医药研究院，广西 南宁 530022；2.广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁 530022）

子宫肌瘤是妇女常见的良性肿块，国医大师班秀文认为其属中医学“癥瘕”“带下”范畴[1]。子宫肌瘤的发生，多因经产时病邪入侵、七情过极、脏腑功能失调等原因，形成瘀血、痰饮、湿浊等有形之邪，停积胞宫，胶结不解，日积月累而逐渐形成肌瘤。治法以活血化瘀，软坚散结，攻坚破积，祛除消块为主[2-3]。

消瘤藤又名肿瘤藤、山枇杷等，为虎耳草科植物星毛冠盖藤Pileostegia tomentella Hand.-Mazz.的藤茎，分布于浙江、江西、福建、湖南、广东、广西、贵州等地[4-6]。《中华本草》[4]认为其具有祛风除湿、散瘀止痛、消肿解毒的功能，主治腰腿酸痛、风湿麻木、跌打损伤、骨折、外伤出血、痈肿疮毒。广西金秀瑶族自治县瑶医医院将其用于子宫肌瘤等多种肿瘤疾病的治疗。消瘤藤用于治疗子宫肌瘤，有可能是通过“散瘀、消肿”的功效发挥作用，有别于现代医学“杀灭肿瘤”的治疗思路，具有一定的特色及新颖性。但消瘤藤在传统医学理论指导下的“散瘀、消肿”功效物质基础及分子作用机制方面的研究仍较为匮乏。本研究拟在前期消瘤藤化学成分研究[7]结合相关文献[8-9]的基础上，通过HPLC-LTQ/Orbitrap-MS分析结合网络药理学技术，对消瘤藤“散瘀、消肿”的分子机制进行分析，对其“散瘀、消肿”功效的物质基础及分子作用机制进行解释，为消瘤藤这一少数民族特色药材的开发利用打下基础。

1 材 料

1.1 仪器 HPLC-LTQ/Orbitrap MS（美国热电公司）；T500型电子天平（常数市双杰测试仪器厂）。

1.2 材料 消瘤藤采自广西金秀县，由广西中医药研究院副主任药师严克俭鉴定为虎耳草科消瘤藤Pileostegia tomentella Hand.-Mazz的藤茎。乙腈、甲酸为色谱纯，其余为分析纯。

2 方 法

2.1 样品制备 将消瘤藤药材粉碎，过40目筛，精密称取粉碎后样品10 g，加入100 mL 95%乙醇回流30 min，共2次，过滤，合并滤液，回收溶剂，滤液蒸干后用无水乙醇定容于100 mL容量瓶中，得到供试液质量浓度为100 mg/mL（以生药计）。

2.2 LC-MS条件 XTerra C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流动相A为0.1%甲酸+2.5 mmol/L乙酸铵水，流动相B为乙腈进行梯度洗脱（0～15 min，90%A～70%A；15～25 min，70%A～30%A；25～30 min，30%A～20%A；30～32 min，20%A～10%A；32～37 min，10%A；37 ～37.10 min，10%A ～90%A；37.10 ～40 min，90%A）；流速：0.2 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：282 nm。ESI离子源；正离子检测；毛细管温度：320 ℃；脱气溶剂温度：350 ℃；脱气溶剂气流量：10 L/min；扫描范围（m/z）：150～2 000；雾化器压力：35 000 kpa；毛细管电压：4 kV；锥孔电压：100 V。

2.3 消瘤藤化学成分及疾病靶点预测 通过HPLC-LTQ/Orbitrap MS分析，得到消瘤藤的化学成分，化合物分子结构用Chemdraw软件绘制，以SDF文件格式保存，依次导入Swiss Target Prediction 数 据 库（http://www.swisstargetprediction.ch/）对靶点进行预测，选择排名前20位潜在的活性靶点。在GeneCards数据库（http://www.genecards.org）、MalaCard数据库（malacard.org）及OMIM数据库（omom.org）检索与“血瘀”“子宫肌瘤”相关的靶点，取交集并与化合物靶点行比对，找出重复项，整理合并得到潜在相互作用靶点。

2.4 “成分-靶点”网络构建 根据靶点预测结果，利用String平台（http://string-db.org/）构建疾病-靶点蛋白相互作用关系，将结果导入Cytoscape 3.6.0软件建立成分-靶点相互作用网络并进行网络分析（Networkanalyzer）。

2.5 GO富集分析 将预测靶点的Uniprot ID导入David 6.8（http://david.ncifcrf.gov），选择Uniprot Accession，对消瘤藤的核心靶点可能存在的生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞组分（CC）进行GO富集分析（P＜0.05），根据P值绘制柱状图。

2.6 KEGG通路富集分析 利用DAVID 6.8导入消瘤藤靶点的Uniprot ID后进行KEGG通路富集分析，并根据富集程度和P值并使用R语言对其可视化作图。筛选出主要信号通路导入Cytoscape 3.6.0进行“成分-靶点-通路”相互作用的构建并可视化。

2.7 分子对接验证 结合“成分-靶点-通路”分析结果，选择节点数量多的关键靶点与其对应的成分进行分子对接，从PDB数据库下载相应的蛋白结构，除去原有的复合物配体后，采用AUTODOCK软件进行对接，并导出对接结果，采用PYMOL作图。

3 结 果

3.1 HPLC-LTQ/Orbitrap MS分析结果 消瘤藤提取物总离子流图见图1。查询国内外消瘤藤及植物化学成分研究相关文献报道[10-15]，同时借助Scifinder和Pubchem数据库，收集整理了消瘤藤中各化学成分的数据，根据一级质谱的准分子离子峰信息和二级质谱的结构碎片信息，推测出了14个化学成分的可能结构；通过与对照品的质谱信息进行比对，1、2、12号峰得到确证，分别是紫丁香苷、茵芋苷、当药苷。（见图2）所有化合物信息，已鉴定和已推测的化合物保留时间、一级质谱、二级质谱和分子信息见表1。

图1 消瘤藤提取物总离子流图

图2 紫丁香苷（A）、茵芋苷（B）、当药苷（C）对照品质谱图

表1 消瘤藤化学成分分析

3.2 消瘤藤化学成分及疾病靶点预测 通过HPLC-LTQ/Orbitrap MS分析，得到消瘤藤的化学成分14个，根据Swiss Target Prediction数据库靶点预测结果，选择排名前20位潜在的活性靶点，共获得280个基因靶点。在GeneCards、MalaCards及OMIM数据库中检索与“血瘀”“子宫肌瘤”相关的靶点，取交集共82个。（见图3）与化合物靶点进行比对，找出重复项，整理合并得到潜在相互作用靶点23个，可以看出消瘤藤主要从抗炎、调控肿瘤细胞凋亡及转移、抗凝血等方面发挥“散瘀、消肿”治疗子宫肌瘤的作用。（见表2）

图3 疾病靶点交集韦恩图

表2 潜在靶点预测

3.3 “成分-靶点”网络构建 根据靶点预测结果，利用String平台构建疾病-靶点蛋白相互作用关系，将结果导入Cytoscape 3.6.0软件建立成分-靶点相互作用网络并进行网络分析（Networkanalyzer）。该网络由39个节点，45条边组成，拓扑学参数信息包括“接近中心度值（closeness）”“中介中心度值（betweenness）”“度值（degree）”。大部分化合物作用于多个靶点，而非仅仅通过一个靶点来发挥作用，如3-羟基香豆素（3-Hydroxycoumarin）、7-羟基-8-甲氧基香豆素[7-(ethylamino)-4,6-dimethylchromen-2-one]、秦皮啶（Fraxidin）、伞形花内酯（Umbelliferone）等，度值（degree）均为5。（见表3）

表3 “成分-靶点”网络拓扑学参数

3.4 GO富集分析 对消瘤藤的核心靶点可能存在的生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞组分（CC）进行GO富集分析。其中P＜0.05和错误发现率（FDR）＜0.05为显著的靶点，经过筛选后共得出124个BP条目，29个MF条目，21个CC条目。GO分析结果表明，BP靶点主要以细胞表面受体信号通路、蛋白质自磷酸化、蛋白质磷酸化的正调控、肽基络氨酸磷酸化等条目为主；MF靶点主要负责蛋白磷酸酶结合、蛋白激酶活性、ATP结合、酶结合等；CC靶点主要分布于受体复合体及质膜。可见消瘤藤发挥“散瘀、消肿”的功效可能参与了蛋白激酶活性、细胞表面受体信号通路、蛋白质磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录等过程。（见图4）

图4 GO 富集分析图

3.5 KEGG通路富集分析[16-17]对消瘤藤的预测靶点使用DAVID 6.8进行KEGG通路富集分析，筛选出7条主要通路，并将其可视化，绘制气泡图。气泡的大小表示基因的数量，气泡越大说明富集在该通路上基因的数目越多；气泡的颜色代表富集的显著性，颜色越红则说明在该通路上富集越显著。可以看出消瘤藤活性成分潜在作用靶点在IGF1R、EGFR等生长因子的诱导因素中富集，并可能通过调控蛋白多糖、黏附斑激酶、Rap1及Ras等多条信号通路发挥其治疗子宫肌瘤的作用。（见表4、图5）

图5 KEGG 通路分析图

表4 KEGG 信号通路富集

3.6 “成分-靶点-通路”网络构建 根据KEGG通路富集分析的结果，筛选出7条相关信号通路，同时和参与相关通路的靶点建立联系，将“成分-靶点”作用关系整合导入Cytoscape 3.6.0，可视化得到“成分-靶点-通路”网络图。该网络由42个节点和177条边组成，网络拓扑分析得到核心靶点，Degree值排名前3位的靶点为EGFR、IGF1R、PIK3CA。（见图6、表5）

图6 “成分-靶点-通路”网络图

表5 网络拓扑参数表

3.7 分子对接结果 结合“成分-靶点-通路”分析结果及网络拓扑参数表，选择节点数量多的关键靶点（EGFR、IGF1R、PIK3CA）与其对应的成分进行分子对接，从PDB数据库下载EGFR、IGF1R、PIK3CA的蛋白结构，除去原有的复合物配体后，采用AUTODOCK软件进行对接，并导出对接结果，PYMOL作图。3-羟基香豆素（3-Hydroxycoumarin）、松柏醇（Coniferin）、伞形花内酯（Umbelliferone）与IGF1R、PIK3A、EGFR的蛋白结构的作用模式主要为氢键及疏水作用。（见表6、图7）

图7 分子对接二维平面图

表6 分子对接结果

4 讨 论

消瘤藤具有散瘀、消肿等功效，本研究对其临床上用于治疗子宫肌瘤的应用进行现代医学的论证。子宫肌瘤在中医学归属于“癥瘕”范畴，血瘀是“癥瘕”形成的基础。《黄帝内经》记载的“血实宜决之”“疏其血气，令其调达”，是中医治疗血瘀的基础。中药治疗恶性肿瘤是通过改善血液流变学及血管正常化起到疏通经络、活血止痛及消肿抑瘤的作用[18-19]。现代研究[20]表明，子宫肌瘤发生发展与性激素及其受体、细胞增殖与凋亡、信号传导途径异常等有关。

本研究通过HPLC-LTQ/Orbitrap-MS方法，从消瘤藤95%乙醇提取物中分析出了14种化合物，主要有苷类成分（紫丁香苷、松柏苷、茵芋苷、当药苷、胡萝卜苷），香豆素类成分[伞型花内酯、7-羟基-8-甲氧基香豆素、秦皮啶、异欧前胡素、Coumarin、3-羟基香豆素、7-(ethylamino)-4,6-dimethylchromen-2-one]，以及生物碱类成分（马钱子碱、伪马钱子碱）等成分。化合物节点度值（degree）表示成分与靶点的相关个数，由“成分-靶点”网络拓扑学参数可知，具有较大度值（degree＞4）的活性成分有7个，即3-羟基香豆素（degree=5）、马钱子碱（degree=5）、伞型花内酯（degree=5）、7-(ethylamino)-4,6-dimethylchromen-2-one（degree=5）、7-羟基-8-甲氧基香豆素（degree=4）、胡萝卜苷（degree=4）。节点度值排名靠前的主要以香豆素类为主。香豆素是一类具有苯骈α-吡喃酮结构的化合物，可看作是顺式邻羟基桂皮酸脱水形成的内酯，绝大多数在C-7位有羟基或烃基。近年来，香豆素类化合物在抗肿瘤药物的研发方面展现出良好的应用前景。研究发现香豆素及其衍生物可抑制多种肿瘤细胞株的生长，并与多条转导通路有关[21]。

GO生物学富集分析发现，消瘤藤的活性成分可影响蛋白激酶活性、细胞表面受体信号通路、蛋白质磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ启动子过程。这些生物学过程很可能涉及血瘀引起的子宫肌瘤的发病原因及治疗手段，同时消瘤藤可能通过改善这些生物学过程发挥其“散瘀、消肿”的作用。KEGG通路及“成分-靶点-通路”分析发现，消瘤藤活性成分潜在作用靶点在IGF1R、EGFR等生长因子的诱导因素中富集。近年来，有研究表明生长因子可以调节甾体激素在肿瘤细胞中的增殖和分化，并对雌激素诱导细胞的生长和分化以分泌的方式在组织局部起作用。子宫肌瘤发生的原因是生长因子的异常表达，肽类生长因子及其受体是肌瘤生长的调节因子[22]。胰岛素样生长因子1受体（insuline-like growth factors 1R，IGF1R）是小的单链多肽类因子，由70个氨基酸组成。动物实验证明IGF1R可在子宫肌细胞产生，且通过卵巢甾体激素控制其表达。IGF1R能促进正常子宫肌细胞和肌瘤的平滑肌细胞进行有丝分裂和分化。有研究表明，孕酮对子宫肌瘤的影响有双重性，一方面通过降低IGF1R抑制子宫肌瘤生长，另一方面则通过增加EGFR和Bcl-2来促进子宫平滑肌瘤生长。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）可刺激细胞增生并影响正常细胞及肿瘤细胞的分化。研究显示子宫肌瘤细胞EGF mRNA含量高于正常平滑肌，从而使离体子宫肌瘤细胞迅速生长[23]。上述消瘤藤“成分-靶点-通路”的网络信息及相关文献显示，消瘤藤可能通过调控蛋白多糖、黏附斑激酶、Rap1及Ras等多条信号通路发挥治疗子宫肌瘤的作用。研究发现，肿瘤的发生发展与蛋白多糖的过度激活密切相关[24]。蛋白多糖（Proteoglycans，PGs）是一种含有长而不分硫支共价结合重复二糖长链的糖蛋白，在细胞中和细胞外基质中含量丰富。近年来，蛋白多糖对生长因子信号的调控使glypican（及其他多聚糖）成为癌症治疗中极具吸引力的研究对象[25]，PGs通常在肿瘤血管生成中表现出促进或抑制肿瘤血管生成作用。

综上所述，经HPLC-LTQ/Orbitrap-MS法及网络药理学技术分析发现，瑶药消瘤藤共有14个不同的活性成分通过对不同的靶点协同作用，起到“散瘀、消肿”的作用。研究结果对瑶药消瘤藤多成分、多靶点、协同作用的特点进行了一定程度上的解释，体现出其通过整体性、系统性来发挥治疗肿瘤作用的特点。本研究发现，消瘤藤可能从以下3个方面发挥“散瘀、消肿”作用治疗子宫肌瘤：（1）从消瘤藤“散瘀、消肿”的功能主治上探讨，其可通过改善血液流变学及血管正常化起到疏通经络、活血止痛、消肿抑瘤的作用。（2）通过调控IGF1R、EGFR等生长因子从而调节甾体激素在子宫肌瘤细胞中的增殖和分化。（3）通过调控蛋白多糖、黏附斑激酶、Rap1及Ras等多条信号通路发挥抗肿瘤作用。预测所得消瘤藤成分疾病靶点与已有文献较为接近，表明基于网络药理学与分子对接相结合的技术手段探讨其“散瘀、消肿”治疗子宫肌瘤的作用机制具有一定的准确性，同时也揭示了消瘤藤多成分、多靶点的特点，可为后续的相关研究提供参考。