表面等离体共振成像用于细菌分析与检测的研究进展

马腾飞,喻肖瑶,赵天涛,吴 进,封 丽

(1.重庆市生态环境科学研究院 水环境工程技术创新中心, 重庆 401147;2.重庆工商大学 国家智能制造服务国际科技合作基地, 重庆 400067;3.重庆理工大学 化学化工学院, 重庆 400054)

0 引言

自1982年Liedeberg等证明了表面等离体共振(surface plasmon resonance,SPR)作为一种光学生物传感器的效用以来[1],SPR技术在生物传感器领域得到了快速的发展和应用。SPR传感器在生物分子相互作用研究方面具有用样量少、无损免标记和实时监测的优势。因此,SPR生物传感器在基础生物学研究[2-5]、药物发现和临床诊断[6-8]、环境和农业监测[9-11]中的应用越来越广泛。

SPR成像技术(surface plasmon resonance imaging,SPRI),也被称为“SPR显微镜”[12],由Rothenhäusler等[13]在1988年首次提出,随后相关领域研究获得了快速增长[14-15]。与传统的SPR生物传感器相比,SPRI提供的是传感器芯片表面区域的平均共振信号随时间的变化情况。利用SPRI技术可以研究芯片表面的特定区域(regions of interest,ROI),通过成像设备(通常是CCD或CMOS相机)记录芯片表面的SPR图像。因此,当芯片表面设计有大量的ROI(如微阵列)时,可以实现高通量的分析。此外,在SPRI系统中引入透镜[16-18](通常在棱镜和相机之间),或者用高数值孔径物镜代替棱镜[19-21]时,可以获得芯片表面的高空间分辨率图像。

SPRI的优点使其不仅可以用于生物分子研究,如蛋白质[22-23]、DNA[24-25]、RNA[26-27],而且可以用于人体细胞研究,如细胞生理变化与表面的相互作用,以及细胞感应等[28]。然而,相比生物分子和人体细胞研究领域,在与人类生产生活和生命健康关联紧密的细菌研究领域,SPRI的应用进展相对缓慢和有限。其主要原因可能是样品复杂的处理要求和潜在的仪器污损问题[28]。随着近些年来SPRI技术的不断发展进步,SPRI技术用于细菌领域的研究也不断增多。

为了引起更多相关领域研究人员的兴趣和关注,展示SPRI技术在细菌分析与检测领域的良好应用前景,总结了过去十年中涉及细菌领域的相关SPRI研究,主要包括SPRI的基本原理介绍,SPRI用于单细菌行为和生物膜分析方面的研究,以及SPRI在细菌检测与鉴定方面的应用情况。同时对SPRI技术未来在细菌分析与检测领域的应用提出了展望,以期为SPRI技术进一步应用于细菌研究相关领域提供参考。

1 SPRI原理简介

当外部光以一定条件入射在金属表面,并在金属/电介质界面上诱导金属的自由电子振荡产生共振时,就会发生SPR现象。因此,在一定的入射角度下,金属吸收了辐射能量并显示出反射率的最小值。这个共振角对与金属表面(通常在垂直方向300 nm内)接触的电介质(即实验中的样品)的折射率极为敏感。当共振角固定时,样品的折射率变化导致反射率的变化,这可以在SPR图像中得到体现。SPRI工作原理见图1[29]。与传感表面的折射率分布相对应的反射光被CCD相机捕捉,并转化为2D强度对比图像[29]。

图1 SPRI工作原理示意图

2 SPRI用于单个细菌研究

2.1 蛋白质与单个细菌相互作用

当与外部配体相互作用时,由于固有的细胞间的异质性,单个细菌细胞的反应可能不同。然而,这种异质性会在细菌群体研究中被忽略了,因为对细菌群体研究中获得的数据通常是许多细菌的平均值。SPRI技术的出现为从单菌水平上测量配体与细菌相互作用的结合动力学提供了新的思路[30]。通过将个体细菌修饰于SPRI芯片表面,随后用SPRI系统对抗体与细菌的结合过程和解离过程进行监测,最后可以从图像序列提取的反射光强度随时间的变化曲线中获得详细的动力学信息。结果表明,尽管所获得的动力学常数的平均值与体外实验研究的数据水平一致,但在结合动力学方面存在着较大的细菌个体间差异,不同细菌个体间的动力学常数甚至存在着若干个数量级水平的差异,这些差异可能与细菌表面抗原表达和分布的不同有关。这项研究显示了细菌与外部配体结合能力的异质性,进而表明了SPRI技术在单个细菌水平上探索细菌生理特性的潜力。

2.2 单个细菌活性研究

细菌由于其自身代谢等生理活动,附着于物体表面时会表现出纳米级别的“抖动”行为,常规的光学显微镜和电子显微镜无法观察到细菌的这种行为,而利用SPRI技术则可以实现对细菌的这种“抖动”行为的监测[31-32]。Syal等[31]通过观察营养物质和不同抗生素作用下细菌在SPRI芯片表面的“抖动”情况,证明细菌在芯片表面垂直方向上的振幅变化可以用来表征细菌活性变化,从而实现对细菌活性的实时快速判定。基于此,SPRI技术可以作为一种快速的抗生素敏感性测试方法[31],较传统的细菌培养方法节省大量时间。类似地,Liu等[32]采用SPRI方法来监测水中存在不同化学物质时单个细菌的活性,从而快速评估化学物质的急性毒理作用。因此,SPRI技术可以作为一种实时快速检测细菌活性的技术手段,从而用于抗菌药物研发和物质毒性毒理方面的研究。

3 SPRI用于细菌生物膜研究

生物膜是细菌存在的一种常见形式,在细菌感染、细菌抗药性和废水处理等领域都有大量研究。传统的生物膜研究方式主要集中于生物膜生物量、表面形貌结构,由于技术手段要求,在取样备样过程中可能对生物膜结构或细菌活性构成损伤,且难以实现实时观测。SPRI技术的出现为生物膜研究提供了一个新的视角。

通过对芯片表面进行修饰模拟生物膜附着生长的基底表面,根据细菌在芯片表面附着生长时产生的光强信号变化,SPRI技术可以实现对芯片表面细菌附着情况和生物膜形成过程的实时监测。Abadian等首次使用SPRI对大肠杆菌和铜绿假单胞的生物膜形成和清除过程进行观察[33],并用SPRI检验了牛血清蛋白和酪蛋白作为表面涂层对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜形成的预防效果[34]。类似地,Aninwene等[35]利用SPRI分别观察了金黄色葡萄球菌在修饰有糖蛋白润滑素(LUB)涂层的芯片和修饰有牛颌下腺粘蛋白(BSM)涂层的芯片表面的附着和成膜能力,结果表明金黄色葡萄球菌在LUB涂层表面的附着和成膜能力下降90%以上,在BSM表面仅下降7%左右。这些研究充分展现了SPRI技术在生物膜研究和抗生物膜材料研发方向的良好应用前景。

4 SPRI用于细菌定性/定量检测

对环境样品或指定样品中的细菌进行定性鉴定和/或定量检测,在污染防治、食品安全和医疗卫生领域均具有重要意义。SPRI技术由于其用样量少、可以实时快速检测的优势,已在细菌鉴定和检测方面显示了巨大潜力。现有研究报道中,根据检测时是否在芯片表面对细菌进行了一定时间的培养,可将检测方法分为非培养检测和培养检测两类。

4.1 非培养检测

非培养检测主要利用细菌的表面特异性实现。常用的方法包括直接检测法和强化检测法。直接检测法通过在芯片表面修饰可以捕获细菌的抗体或其他物质,从而将样品中的细菌固定在芯片表面,由此产生的SPRI检测信号变化表明细菌的存在并用于计算细菌的数量。当样品中细菌含量较低时,直接法检测信号弱,检出限高,因此其使用较为受限。强化检测法是在直接检测法的基础上通过在捕获的细菌表面流过含有特异性抗体或探针的溶液,实现对SPRI检测信号的进一步放大。强化法检出信号强,检出限低,可以检出样品中较低含量的细菌,因此,得到研究人员的更多关注。

Yodmongkol等[36]采用强化检测法对溶液中的白色念珠菌进行检测。首先在SPRI芯片表面修饰一层11-巯基十二烷酸分子层,用于固定白色念珠菌特异性抗体,当溶液中的白色念珠菌被芯片表面的抗体捕获后,再次在溶液中流过白色念珠菌特异性抗体,从而实现检测信号的放大。由于使用了针对白色念珠菌表面特异性抗原的特异性抗体,该方法可以从白色念珠菌、大肠杆菌、变异链球菌、金黄色葡萄球菌、β-链球菌和干酪乳杆菌的混合样品中检测出白色念珠菌的含量。类似地,Puttharugsa等[37]采用强化检测法对植物样品中致病菌Acidovoraxavenaesubsp.citrulli(Aac)进行检测,在使用多克隆抗体对SPR信号进行放大后,SPRI系统对Aac的检出限可达5×105CFU/ml。

除了利用细菌表面特性进行检测,Foudeh等[38]提出利用环境中细菌的16s rRNA进行定性检测。因为环境中RNA的存在与活细菌活动直接相关,而死亡的细菌的RNA会快速降解[39]。Foudeh等[38]采用SPRI技术对水体中引发军团病的Legionellapneumophila细菌进行检测,对L.pneumophila16s rRNA的检测方法与细菌强化检测法类似,首先在SPRI芯片表面修饰上与L.pneumophila16s rRNA互补的DNA探针,然后将含有目标RNA,以及可以与目标RNA互补的识别探针的样品流过芯片表面,样品中的目标RNA被DNA探针所捕获,同时识别探针也与被捕获的RNA结合,而识别探针上同时含有可与量子点结合的基团,当最后含有量子点的溶液加入后,被捕获的RNA因结合了量子点,产生的SRPI信号得到进一步放大,从而实现了对水环境样品中RNA在亚飞摩尔(sub-femtomole)水平上的快速检出。

4.2 培养检测

非培养检测法中的直接法由于对低浓度细菌样品检测信号弱而应用受限,因此研究人员考虑对芯片表面捕获的细菌进行培养,以增强检测信号。Bouguelia等[40]研究发现,随着细菌增殖,SPRI信号不断增强,可以根据细菌浓度变化、细菌世代时间、SPRI信号变化和培养时间之间的量化关系,反推出培养初期的细菌浓度,即样品中的细菌浓度。该方法可用于对Salmonellaenterica,Streptococcuspneumoniae和EscherichiacoliO157∶H7的检测,检出限可低至(2.8±19.6)CFU/mL。类似地,基于培养检测法,Morlay等[41]采用SPRI技术实现婴儿配方粉中的食品病原体克罗诺杆菌和沙门氏菌的快速检测,检出限可达30 CFU/25g奶粉;Mondani等[42]实现对不同温度范围内保存的食物样品中E.coliO157∶H7的有效检测;Mallevre等[43]则利用SPRI技术观察了纳米氧化银压力下细菌的生长情况,实现了实时毒性检测研究。

非培养检测方法中的强化检出法可以获得较好的检出限,但使用的抗体普遍较昂贵,因此研究人员也尝试通过采用较为经济的物质替代抗体的方式来降低实验成本。Bulard等[44]采用碳水化合物修饰到芯片表面以固定细菌。当细菌被固定到芯片表面后,实时记录生物芯片上细菌生长的SPRI信号。通过对细菌SPRI信号和对照信号处理获得不同菌株的“差分时间”,进而得到碳水化合物芯片对不同菌株的指纹图谱。该方法可以实现10 h内对5种初始浓度仅为102CFU/mL的大肠杆菌菌株的有效区分和检测,在食品安全领域显示出良好的应用前景。

5 结束语

SPRI技术具有样品用量少、实时快速和样品无损监测/检测的优点,在环境、农业、食品安全和医疗卫生领域的细菌分析与检测方面具有良好的应用前景。未来仍有许多需要深入研究的地方,以进一步提高细菌检测结果的精准度和细菌生理机制等方面研究的深度,以及继续降低实验成本等。相关的研究方向包括但不限于:① 实际样品预处理方法,如对影响背景信号的高盐度样品进行脱盐处理;② SPRI芯片的修饰及再生方法,如结合目标菌株表面特性寻找或研发吸附结合力强且对细菌活性影响较小的芯片修饰物质,研制廉价易再生的芯片修饰涂层等;③ SPRI与其他技术的结合应用,如与电化学技术结合,检测小分子物质与细菌的结合动力学[45],或是与质谱技术进行结合,探究不同条件下细菌分泌胞外蛋白和代谢产物情况[46];④ 对图像数据处理方法进行优化,如引入计算机深度学习[47]等算法提升数据处理精准度等。