苗药五藤膏外敷对膝关节骨关节炎兔软骨GSK-3β、Notch4表达的影响

王颜君,周 静,马武开,范红芬,韩 珊,卢林菊

(贵州中医药大学第二附属医院,贵州 贵阳 550001)

膝关节骨关节炎(KOA)是以关节软骨退变和骨质硬化、增生为特征的慢性、进展性、退行性关节病,表现为膝关节疼痛、肿胀、功能障碍等,若不及时治疗,可能会导致关节变形甚至关节功能丧失,给患者、家庭及社会造成沉重的负担[1]。KOA的病因至今尚不清楚,治疗目的在于减轻炎症反应,缓解关节疼痛,改善关节功能,治疗措施主要包括药物治疗、物理治疗以及手术治疗等。近年来分子生物学的深入研究发现,Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)是调控骨生长和骨骼代谢的关键信号通路,其下游靶点糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)的活性影响成骨细胞分化和凋亡,在KOA发展过程中发挥重要作用[2-3];Notch信号通路参与骨代谢,能调节软骨细胞生长与分化,维持软骨细胞的形态及平衡软骨基质代谢[4-5]。课题组前期研究发现,苗药五藤膏治疗KOA能减轻患者的关节疼痛和僵硬症状,改善关节功能和活动度,同时中药外治不良反应较小[6]。本研究在前期研究基础上,通过观察苗药五藤膏外敷对兔KOA关节软骨组织中GSK-3β、Notch4表达的影响,旨在探讨苗药五藤膏治疗KOA的可能作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 选取由贵州中医药大学动物实验中心提供的新西兰大白兔72只,4～5月龄,雌雄各半,体重2～3 kg,合格证号:SCXK(黔)2018-00012,实验遵循实验动物伦理要求。

1.2药物 苗药五藤膏(黑骨藤、大血藤、小花青风藤、香血藤、络石藤研成粉,与凡士林按1∶1配比调制,由贵州中医药大学第二附属医院药剂科提供,黔药制字Z20120072),氟比洛芬巴布膏(日本三笠制药株式社会)。

1.3主要试剂及实验仪器 RIPA裂解液(碧云天),BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天),兔多抗GAPDH(杭州贤至生物有限公司),兔多抗GSK-3β(LSBio),兔多抗Notch4(Invitrogen),蛋白Marker(海利克思),微量移液器(Eppendorf),磁力搅拌器(江苏省金坛市中大仪器厂),离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.4实验方法 采用随机数字表法,将72只家兔分为空白组、模型组、巴布膏组、苗药五藤膏高剂量组、苗药五藤膏中剂量组及苗药五藤膏低剂量组,每组12只。除空白组正常饲养外,其余组兔均采用经典的木瓜蛋白酶膝关节内注射方法建立KOA模型[7],即在第1,4,7天分别于兔右膝关节注射0.3 mL木瓜蛋白酶生理盐水溶液(含4%蛋白酶),饲养4周。造模后第5周开始,空白组和模型组每日用无菌纱布包扎右膝关节4 h,连续4周;巴布膏组将巴布膏(约2 g)剪至40 mm×30 mm大小,直接贴敷于兔右膝关节4 h,苗药五藤膏低、中、高剂量组分别将约1 g、2 g、4 g的苗药五藤膏均匀涂抹于纱布上制成的贴膏(贴膏面积大小分别为20mm×30mm、40 mm×30 mm、80 mm×30 mm)直接贴敷于兔右膝关节4 h,均1次/d,连续干预4周。家兔药物使用剂量均与人体等效剂量相当[8],同时为防止药物挣脱,各药物组均用绷带包扎固定。

1.5检测指标及方法

1.5.1软骨病理学形态 干预结束后,采用空气栓塞法处死各组兔,从右侧膝关节处剥除皮肤,取出右侧股骨内髁顶点钙化层以上的软骨,经甲醛固定、硝酸脱钙、石蜡包埋处理后,将病理标本进行常规切片,放入60 ℃烤箱烤片3 h,脱蜡后用苏木素-伊红(HE)染色,观察并记录各组病理标本的形态。参照改良版Mankin关节软骨病理评分[9],对软骨病理情况进行评估。

1.5.2关节软骨组织中GSK-3β、Notch4蛋白表达情况 采用Western blot法检测:按照说明书要求在EP管中加入剪碎的软骨组织、钢珠及裂解液(含2 μL PMSF、2 μL磷酸酶抑制剂)进行匀浆、裂解、离心,将蛋白样品(经PBS稀释20倍)、标准品(经BSA标准品稀释)及BCA试剂盒中的混合液(A液和B液按50∶1比例混合)依次加入96孔板内,37 ℃避光孵育后,用酶标仪(DG-3022A)测定OD值(OD568),按OD值和标准蛋白浓度通过直线回归拟合算出蛋白样品浓度,再利用BandScan分析胶片灰度值。

2 结 果

2.1各组兔膝关节软骨组织病理形态 光镜下见空白组关节软骨表面平整光滑,结构清楚,潮线清晰,无变性或萎缩;模型组关节软骨表面凹凸不平,结构模糊,潮线难以识别,发生重度变性、萎缩;各药物组软骨组织破坏程度较模型组轻,其中苗药五藤膏高剂量组关节软骨表面更为光滑平整,结构更加清晰,潮线识别度更高,仅发生轻度的变性、萎缩,而苗药五藤膏低、中剂量组及巴布膏组均伴有不同程度的关节肿胀和滑膜充血,结构层次较为模糊,个别潮线识别度不清,发生中度变性、萎缩。见图1。

图1 空白组和膝关节骨关节炎各组兔关节软骨组织病理形态(HE染色,×200)

2.2各组兔膝关节软骨组织Mankin评分 模型组Mankin评分为(12.30±1.25)分,明显高于空白组的(0.90±0.74)分(P<0.05);巴布膏组及苗药五藤膏低、中、高剂量组Mankin评分分别为(4.70±0.82)分、(7.80±0.63)分、(4.80±0.63)分、(3.40±0.70)分,均明显低于模型组(P均<0.05),且苗药五藤膏高剂量组均明显低于其他药物组(P均<0.05),巴布膏组、苗药五藤膏中剂量组均明显低于苗药五藤膏低剂量组(P均<0.05)。

2.3各组兔膝关节软骨组织中GSK-3β、Notch4蛋白表达情况 模型组GSK-3β、Notch4蛋白相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05);各药物组GSK-3β、Notch4蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05);各药物组间GSK-3β蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05);巴布膏组和苗药五藤膏高剂量组Notch4蛋白相对表达量均明显低于苗药五藤膏低、中剂量组(P均<0.05)。见图2及表1。

表1 空白组和膝关节骨关节炎各组兔关节软骨组织中GSK-3β、Notch4蛋白相对表达量比较

图2 空白组和膝关节骨关节炎各组兔关节软骨组织中GSK-3β、Nocch4蛋白表达条带

3 讨 论

OA属中医学“骨痹”“痹证”等范畴,在苗医学中称为“冷骨风”。苗医认为“冷骨风”是冷风毒壅塞筋脉所致,治宜通筋活血。苗药五藤膏是贵州民族民间外用经验方,方中黑骨藤为君药,有祛风通络、止痛的功效,现代药理学研究发现其具有抑制炎症反应、缓解疼痛、抗氧化及提高免疫力等作用[10];小花青风藤和香血藤祛风除湿、通经活络,为臣药;佐药为大血藤、络石藤,能温经通络、利关节;少许冰片作为使药,起到透邪、透皮的作用并促进药物吸收;诸药合用,共奏通筋散血之功。前期申海艳等[11]实验研究发现,苗药五藤膏能通过调控Wnt信号通路,促进KOA兔患膝关节软骨细胞β-catenin蛋白表达,下调关节软骨细胞Wnt信号下游基因基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、原癌基因(c-myc) mRNA的表达而延缓病情进展。

现代研究认为,骨关节炎是由于关节软骨细胞、软骨外基质及软骨下骨质的合成和降解失衡所致,而软骨和软骨下骨改变是骨关节炎发生的关键因素。在疾病进展中,Wnt信号活性变化可能会影响软骨下骨生长板的破骨活性,导致关节边缘硬化或骨赘形成[12]。β-catenin是Wnt信号通路中的重要调控因子,在软骨细胞分化、成熟和凋亡中起关键作用,存在于细胞膜、细胞质及细胞核内[13]。Wnt/β-catenin通路的活性受β-catenin表达水平的影响,研究发现β-catenin在KOA患者关节软骨组织中过度表达[14]。而β-catenin的表达受由轴蛋白(Axin)、酪蛋白激酶1α(CK1α)及GSK-3β等所组成的降解复合物调节,其中GSK-3β在机体受外源性刺激后失活,导致β-catenin无法磷酸化,细胞质中β-catenin蛋白积聚被转运至细胞核,并与转录因子淋巴增强因子(LEF)-1/T细胞因子(TCF)结合激活其下游靶基因转录[15]。因此GSK-3β既为Wnt/β-catenin通路的重要负调控因子,又是Axin的关键组成部分[16],其活性能维持软骨细胞的完整性和细胞外基质结构。本研究实验结果显示,苗药五藤膏中、高剂量组的软骨破坏较轻;各药物组GSK-3β蛋白相对表达量均明显低于模型组,各药物组间比较差异均无统计学意义。提示苗药五藤膏可下调GSK-3β蛋白表达水平,抑制Wnt信号通路的活化,减少下游炎症因子表达,从而减轻关节软骨损伤。

Notch信号通路不仅与软骨细胞的增殖、分化密切相关,还参与软骨的发生、发育,其配体的过度表达可能会损害破骨细胞和成骨细胞前体,从而阻碍细胞分化[17-19]。相关研究显示,Notch信号通路通过调节细胞凋亡和炎症因子影响关节软骨细胞的稳定性,并在骨关节炎进展过程中起双重调节作用[20-21]。尽管Notch信号通路在KOA中的作用机制尚未阐明,但相关实验发现,当Notch1和Notch4蛋白处于异常激活状态时,Notch信号能连续刺激巨噬细胞释放炎性因子,引起骨代谢紊乱和骨赘增加[22-23]。本实验结果显示,模型组Notch4蛋白相对表达量明显高于空白组,由此推测Notch信号通路中Notch4受体蛋白表达水平与KOA的发生发展有密切的联系;苗药五藤膏各组Notch4蛋白相对表达量均明显低于模型组,说明苗药五藤膏可通过抑制软骨组织中Notch4蛋白表达,减轻炎症反应并抑制细胞凋亡。

综上所述,苗药五藤膏可延缓KOA软骨退变及病情进展,其作用机制可能与调节Wnt/β-catenin和Notch信号通路,抑制GSK-3β和Notch4蛋白表达相关,未来还需对Wnt/β-catenin和Notch信号通路确切的作用机制进行更深入的探索。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。