HPLC-MS/MS 法测定黑枸杞中9 种酚酸

王 远，刘 洋，张金磊，邢丽杰

（1.新疆农垦科学院分析测试中心，新疆 石河子 832000；2.石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000）

黑枸杞（Lycium ruthenicum Murray，LR） 是属于茄科，枸杞属的一种功能性果实[1]。动物和细胞学试验表明，黑枸杞果实提取物具有多种生物活性[2-4]。植物化学研究发现，黑枸杞果实含有丰富的营养成分，包括可溶性糖、脂肪酸、矿物质、酚酸和黄酮类等物质[5]。其中，酚酸类化合物引起了很多研究者的关注，是因为这类化合物具有包括抗氧化和抗炎在内的多种生物功能[6-7]。但是，大多研究者对黑枸杞中多酚类化合物的研究致力于阐明提取物中的总酚含量和生物活性，而较少有对黑枸杞中酚酸类物质进行定量分析的相关报道。

目前，对于复杂天然植物提取物中酚酸类化合物的定量研究方法主要包括分光光度法、薄层色谱法、毛细管电泳法和高效液相色谱法等[8]。其中，分光光度法操作简单、分析速度快，只能用于总酚的定量分析，无法对单一酚酸进行定量分析；薄层色谱法和毛细管电泳法可以实现单一酚酸的分离，但定量分析能力和重现性差；高效液相色谱- 串联质谱具有较高的分离和检测水平，可以同时完成物质鉴定和定量分析，具有灵敏度高、选择性强、准确度高的优点[9]。目前，这种技术已经广泛用于复杂植物提取物中化合物的分析鉴定。

建立了一种利用高效液相色谱串联三重四极杆质谱定性定量分析黑枸杞中9 种酚酸的方法，并对其线性度、回收率、精确度和稳定性进行了评价，比较了不同提取溶剂的提取效率，以期为黑枸杞的利用提供依据。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

乙腈、甲醇（HPLC 级），美国Fisher 公司提供；甲酸（HPLC 级），德国CNW 公司提供；9 种酚酸类标准品，德国Sigma 公司提供；HLB 固相萃取小柱，美国Waters 公司提供；滤头（0.22 μm，φ13 mm），上海安谱实验科技股份有限公司提供。

1200+6460 型液质谱联用仪（配电喷雾ESI 离子源），美国Agilent 公司产品；BSA4202S-CW 型电子天平，德国Sartorius 公司产品；MS3 Basic 型涡旋混匀器，德国IKA 公司产品；旋转蒸发仪，日本EYELA 公司产品；Multifuge X4R Pro-MD 型高速冷冻离心机，美国ThermoFisher 公司产品；IQ 7000 型超纯水净化仪，美国Milli-Q 公司产品。

1.2 标准溶液配制

分别准确称取10 mg 的绿原酸、芥子酸、丁香酸、阿魏酸、异阿魏酸、咖啡酸、香草酸、对香豆酸、4 - 羟基苯甲酸9 种标准品于10 mL 容量瓶内，采用甲醇分别溶解，定容至容量瓶刻度线，配制成1 000 mg/L 的单个标准储备液。准确移取0.1 mL 的9 种酚酸单个储备液于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻线，稀释成1.0 mg/L 的9 种酚酸混合标准中间液。最后使用甲醇- 水（1∶1） 溶液将中间液逐级稀释成2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200 ng/mL 的系列混合标准工作液。标准工作液现用现配。

1.3 样品前处理

（1） 提取。称取5.00 g 黑果枸杞样品于50 mL离心管中，加入乙酸乙酯15 mL，涡旋提取1 min，以转速10 000 r/min 离心5 min。取上清液于茄形瓶中，于45 ℃水浴旋蒸至近干。待净化。

（2） 净化。HLB 固相萃取柱依次用甲醇5 mL，0.01 mol/L 盐酸溶液5 mL 活化；将茄形瓶中提取液过HLB 固相萃取X 小柱。用水5 mL 淋洗、抽干，甲醇10 mL 洗脱，收集洗脱液。于40 ℃氮吹至近干，用50%的甲醇- 水（1∶1） 溶液1 mL 溶解，经0.22 μm 滤头过滤后，供液质谱联用仪检测。

1.4 色谱条件

色谱柱：安捷伦InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×100 mm，2.7 Micron）；流动相：乙腈（A），水（B）；流速0.4 mL/min；柱温30 ℃；进样量5.0 μL；梯度洗脱程序：0 min，5%A；0～5 min，10%A；5～8 min，15%A；8～11 min，15%A；11～12 min，18%A，12～22 min，18%A；22～23 min，90%A；23～24 min，90%A；24～25 min，5%A；25～28 min，5%A。

1.5 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI-）；扫描模式：MRM多反应监测模式；毛细管电压3.5 kV，干燥器流速10 L/min，干燥器温度325 ℃，鞘气温度350 ℃，鞘气流速12 L/min，雾化器压力45 psi。

多反应监测离子对及质谱参数见表1。

表1 多反应监测离子对及质谱参数

2 结果与分析

2.1 提取溶剂优化

目标酚酸类化合物具有较大的极性差异。乙酸乙酯因具有较强的极性和渗透性而被广泛用于天然植物产物中活性物质的提取[10]。Pedro A C 等人[11]研究发现水基溶剂对红枸杞中的酚类化合物具有更好的提取效果。Stenoeva J P 等人[12]研究表明在提取溶剂中加入低含量的酸可以提高总酚的提取效率。为了研究溶剂类型对提取效果的影响，比较了水、乙酸乙酯和0.01 mol/L 盐酸溶液从样品底物中提取9 种目标酚酸的效率。采用回收法测定不同提取溶剂的提取效率。将9 种酚酸的混合标准溶液以100 μg/kg的加标量添加到样品底物中。搅拌静置一段时间后加入15 mL 提取液。

3 种溶剂提取测定黑枸杞中9 种酚酸化合物的回收率见图1。

图1 3 种溶剂提取测定黑枸杞中9 种酚酸化合物的回收率

水和0.01 mol/L 盐酸溶液作为提取溶剂时的平均回收率分别为52.9%和64.1%。结果表明，在溶剂中加入低含量的酸可以提高酚类物质的提取效率，与Stenoeva J P 等人[12]研究结果相同。然而，在使用0.01 mol/L 盐酸溶液作为提取溶剂时，香草酸、丁香酸和异阿魏酸的回收率低于60%。可能是因为水溶剂体系只对含有糖基的酚类物质才会有更高的提取效率。相比较乙酸乙酯，9 种目标化合物的加标回收率为74.0%～104.6%，回收率均较好。主要原因是乙酸乙酯作为提取溶剂时对样品的渗透性更强，共萃取物较少。因此，选择乙酸乙酯作为提取溶剂。

2.2 方法学验证

2.2.1 加标回收率试验

为了评价所建立的黑枸杞中酚酸类化合物检测方法的准确度和精密度，将酚酸混合标准溶液分别以50，100，200 μg/kg 的加标量添加到黑枸杞空白样品中，测定回收率和RSD。

黑枸杞中9 种酚酸的加标回收率及其RSD（n=6） 见表2。

表2 黑枸杞中9 种酚酸的加标回收率及其RSD（n=6）

由表2 可知，在3 个加标水平下，9 种酚酸类化合物的平均回收率在76.4%～106.2%，重复测定5 次，RSD＜4.1%，结果表明所建立的方法准确度和精密度均较好。

2.2.2 线性范围及检出限、定量限

将酚酸混合标准溶液加入到空白样品提取液中，使用建立的方法进行测定。分别以质量浓度和相应的色谱峰面积为横坐标和纵坐标，绘制标准曲线。9 种酚酸化合物在相应的线性范围内线性关系良好，R2＞0.999。

9 种酚酸的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限见表3。

表3 9 种酚酸的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

所建立方法的检测限LOD 定义为样品溶液中信噪比为3 时计算检出质量浓度；检测限LOQ 定义为目标化合物在样品溶液中信噪比为10 时计算检出质量浓度。由表3 可知，9 种酚酸化合物的LOD 为0.3～1.6 μg/kg，LOQ 在1.0～5.0 μg/kg。与已报道的酚酸类化合物的检测方法相比，该方法具有较低的LOD 和LOQ。

3 结论

黑枸杞具有多种生物学活性，其提取物在抗炎、抗氧化类功能食品开发中具有广泛的应用前景。针对黑枸杞提取物中的酚酸类活性成分提取利用率低、定量分析困难的问题，利用高效液相色谱串联三重四极杆质谱建立了一种可以快速定性定量分析黑枸杞中9 种酚酸的方法，并对提取溶剂进行了优化。结果表明，乙酸乙酯作为提取溶剂时，9 种酚酸的平均回收率为93.66%，提取效率最高。在最优条件下，9 种酚酸在线性范围内具有良好的线性关系，相关系数R2＞0.999，检出限在0.3～1.6 μg/kg，定量限在1.0～5.0 μg/kg。在50，100，200 μg/kg 的加标水平下，酚酸化合物回收率为76.4%～106.2%，RSD＜4.1%。该方法前处理操作简单，具有较高的灵敏度和精密度，可用于天然植物提取物中酚酸类化合物的定性定量分析。