液相色谱-三重四级杆质谱法测定水中硝基酚类化合物

王建军

（甘肃省中心实验室，甘肃 兰州 730050）

硝基酚类化合物对生态环境有较大的破坏，对人体健康也会造成较严重的伤害，它会与生物体中蛋白质发生一系列化学反应，导致细胞变异，严重时会使体内蛋白质凝固，导致昏迷或者死亡[1]。硝基酚类化合物一般呈现为黄色的晶体状，在工业、医学、材料领域发挥着不可或缺的作用[2-4]，酚类化合物所释放出的毒性在自然环境中降解缓慢[5]，早年国外已将酚类化合物作为环境污染重点监测因子，中国在20世纪90年代也将部分酚类化合物作为主要监测对象[6]。到目前为止对硝基酚类化合物的监测分析较为重要，主要的分析方法有分光度光度法[7]、液相色谱法[8-9]、液相色谱/串联质谱法[10]、气相色谱法[11]、气相色谱-质谱法[12-13]等。文章前处理采用超声萃取净化、离心及过滤，用超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪测定水中4种硝基酚类化合物，该方法操作简便，精密度和准确度良好。

1 实验

1.1 仪器和试剂

超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪，型号TQD，配备ESI和多反应监测模式，Waters公司；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.5 μm，2.1×100 mm）；KH-500 DE型数控超声波清洗器（昆山禾创）；离心机（博科）。

4种硝基酚类化合物标准贮备液（Reagecon公司，Ireland，100 μg/mL）；内标贮备液（2，4-二硝基苯酚-d3，Reagecon公司，Ireland，50 μg/mL）；甲醇、正己烷、二氯甲烷、甲酸、甲酸铵均为液相色谱纯；氨水（优级纯）；滤膜（0.22 μm，聚氟乙烯）。

1.2 实验条件

1.2.1 液相条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.5 μm，2.1×100 mm）；进样量：2.0 μL；流速：0.2 mL/min；柱温：30 ℃；流动相：甲醇（相A）和甲酸铵-甲酸溶液（相B，0.01 mol/L，pH=4），梯度洗脱程序见表1。

表1 液相洗脱程序

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源，负离子电离模式；MRM多反应监测模式；离子源温度：150 ℃；毛细管电压：2.95 kV；干燥气温度：450 ℃；干燥气流量：60 L/hr，驻留时间：0.028 s。其他参数见表2。

表2 质谱参数

1.3 实验步骤

1.3.1 标准使用液

取4种硝基酚类化合物标准贮备液（100 μg/mL）100 μL用甲醇定容到10.0 mL作为中间液（1.0 μg/mL），取中间液100 μL用甲醇定容到1.0 mL作为标准使用液（100 μg/L）。

取内标贮备液（2，4-二硝基苯酚-d3，50 μg/mL）40 μL用甲醇定容到10.0 mL作为标准使用液（200 μg/L）。

1.3.2 工作曲线绘制

分别用纯水稀释4种硝基酚类化合物的混合准使用液（10 μg/L）至1.0 mL，配制标准曲线浓度点为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L，加入内标使用液（200 μg/L）10 μL，内标物的浓度为2.0 μg/L。以酚类化合物浓度为横坐标（x），以相应化合物与内标峰面积的比值为纵坐标（y），制作工作曲线。

1.3.3 样品的采集、保存及前处理

采集水样时需要将250 mL带盖的棕色玻璃瓶采集满，不能留有空隙，将水样的pH用甲酸或者氨水调节到7～9。样品于4 ℃以下冷藏避光保存，且不能超过7 d。选用玻璃注射器移去取5.0 mL样品于10.0 mL的具塞玻璃管中，加入1.0 mL二氯甲烷和正己烷混合溶液（体积比2∶1），于常温下超声萃取净化10 min，转移至离心机，在4 500 r/min的速度下离心10 min，静置5 min后，取1.0 mL经0.22 μm滤膜过滤后的水相层，加入1.0 mL内标使用液，摇匀后上机测定。以保留时间和特征离子定性，内标法定量。

2 结果与讨论

2.1 4种硝酚类化合物的定性分析

配制好的标准样品经Waters-TQD超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪分离检测，其响应高，分离度好，如图1所示。

图1 4种硝基酚类化合物标准色谱图

2.2 4种硝基酚类化合物的线性范围和检出限

根据以上实验条件，4种酚类化合物在0.5～50.0 μg/L的线性范围内，线性良好，相关系数均大于0.995，能够满足定量检测要求。当取1.0 mL空白样品（加标量为2.0 μg/L），依据上述方法重复测定7次，计算标准偏差S，依据公式MDL=S×t（n-1，0.99）计算检出限，得到检出限和测定下限见表3。能够满足生活污水、工业废水、地表水和地下水的检测要求。

表3 线性回归方程

2.3 精密度和准确度

取地下水样品，加标浓度为5.0 μg/L、10.0 μg/L和20.0 μg/L的低、中、高3个浓度点，依据上述实验条件，每个浓度点重复测定6次，计算相对标准偏差和加标回收率。实验数据见表4。

表4 精确度和准确度实验

由表4可知，加标量在5～20 μg/L范围内，回收率为71.5%～128%，相对标准偏差为1.0%～4.6%，其准确度高，精密度良好。

2.4 实验条件的优化

2.4.1 pH对目标化合物的影响

实验分析了不同pH条件下，对目标化合物加标回收率的影响程度。调节水样的pH分别为3.5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，根据上述实验过程，进行超声萃取净化、离心，上机分析得到加标回收率。发现4种硝基酚类化合物的回收率伴随水样pH的升高而增加，当pH升高至7时，4种酚类化合物的回收率呈现平稳状态，并且回收率基本大于90%。结果如图2所示。

图2 pH对目标化合物的影响

2.4.2 超声萃取净化与振荡萃取净化的对比

实验中对比了超声萃取净化和振荡萃取净化2种方法，对4种酚类化合物的加标回收率和净化效果的影响。取废水样品5.0 mL，加标量分别为1.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L，每个浓度点准备2个样品，分别进行超声萃取净化和振荡萃取净化。结果如图3所示。

分别取5.0 mL地下水、废水、地表水各2份，进行超声萃取净化和振荡萃取净化，比对2种净化方法的净化效率，结果如图4所示。

图3 超声萃取与振荡萃取加标回收率的对比

图4 超声萃取与振荡萃取的净化效率对比

由图3和图4可知，在实验条件下，相同的加标浓度，超声萃取净化和振荡萃取净化的加标回收率均在80%以上，但超声萃取净化的加标回收率普遍高于振荡萃取净化，而且超声萃取净化的效率优于振荡萃取净化的效率，说明在样品量较少的情况下，应用超声波的空化效应和机械效应，使得分子运动速度增大，从而加强其扩散和传播过程，大大提高了萃取效率。振荡萃取在样品量较少的情况下，受振荡幅度的限制，物质反应相比超声萃取不完全，从而影响其萃取效率。

3 结论

通过超声萃取净化-超高效液相色谱-三重四级杆质谱法测定水中4种酚类化合物的实验表明：水样pH在7～9时，4种硝基酚类化合物的响应高、分离度和回收率较好。采用超声萃取净化，提高了目标化合物的加标回收率，降低了杂质的响应，提高了净化效率。在实验条件下，4种硝基酚类化合物加标浓度范围为5～20 μg/L时，平均回收率为71.5%～128%，相对标准偏差为1.0%～4.6%。该实验精密度和准确度良好，并且操作较为简便，检出限较低，可以满足地下水、地表水、污水、工业废水中4种硝基酚类化合物的检测要求。