基于加权基因共表达网络分析探究养肺方治疗非小细胞肺癌的作用机制及实验验证*

庄垚雪,林事成,刘殿娜,高磊,孙静宜,魏佳,李泉旺

1.北京中医药大学,北京 100029; 2.北京中医药大学东方医院,北京 100078

肺癌是全球范围内发病率较高的一类疾病,其死亡率位居各类癌症的第一名,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌的85%[1-2]。NSCLC早期治疗以根治性手术联合放化疗为主,中晚期治疗以放化疗为主,复发率较高,生存期不佳[3]。多项国内外研究证明,中医药具有较好的抗肿瘤辅助治疗及对症支持治疗疗效,能够显著提高肿瘤患者的总生存期[4-6]。首都名医王沛教授认为肺癌的主要病机是正气内虚,从而导致肺络受损、痰瘀毒聚,故以益气养阴为法,以“扶正”作为治疗之本,以沙参麦冬汤为基础,自拟养肺方以滋阴扶正、解毒散结,临床观察表明具有较高的安全性及较好的临床疗效[7-8]。本文首先通过网络药理学联合加权基因共表达网络分析(weighted correlation network analysis,WGCNA)初步探究养肺方治疗非小细胞肺癌的核心靶点、关键通路,然后基于非小细胞肺癌PC9细胞进行实验验证,以期为临床养肺方抗肺癌的应用及中医药防癌治癌机制的阐明提供参考。

1 基于网络药理学和加权基因共表达网络分析探究养肺方治疗非小细胞肺癌的作用机制

1.1 资料与方法

1.1.1 养肺方活性成分、靶点的筛选在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)[9-10]查找养肺方组方中药的化学成分,筛选条件为口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、类药性指数(drug-likeness,DL)≥0.18,确定养肺方的活性成分。利用中医药百科全书(the encyclopedia of traditional Chinese medicine,ETCM)预测养肺方活性成分相关靶点[11],以Tanimoto>0.8作为筛选标准,获得养肺方的总靶点。

1.1.2 差异基因分析运用GEO平台[12]下载基因芯片GSE118370。采用GEO2R归一化数据并分析差异基因,差异基因筛选标准:|logFC|≥1且P<0.05。R包ggplot2[3.3.3版本]绘制PCA图、热图和火山图。

1.1.3 WGCNA分析WGCNA是用于描述不同样本之间基因关联模式的生物学方法[13]。运用 WGCNA R studio函数(R包)构建共表达网络,软阈值估算运用pick Soft Threshold 函数。根据基因的内部连通性和软阈值,将mRNA聚集成不同的共表达模块,进而构建拓扑重叠矩阵(topological overlap matrix,TOM),利用hclust函数对TOM进行层次聚类,并根据拓扑重叠异度(1-TOM)对基因进行分组,最后利用dynamic tree cut算法来确定基因模块。Module member ship(MM)是基于基因表达水平的不同,通过计算模块中基因与模块特征基因的相关性的高低,从而确定模块中的关键基因,MM值高说明模块中的基因关联性越高[11]。

1.1.4 “药物-成分-靶点”网络的构建利用Cytoscape 3.7.2软件,导入养肺方组方中药、有效成分及相关靶点基因和NSCLC差异基因构建的“药物-活性成分-靶点”网络文件,进而构建“药物-活性成分-靶点”可视化网络。网络图的节点(node)分别为药物、活性成分、靶点。各节点之间的相互关系以边(edge)表示。利用 CytoNCA 插件对网络图进行分析,设置“节度值(Dgree DC)>2倍中位数”,筛选养肺方治疗NSCLC的有效药效成分。

1.1.5 蛋白相互作用(protein-protein interaction networks,PPI)网络的构建将WGCNA中筛选出的Hub基因与药物靶点取交集得到治疗靶点,导入STRING11.15平台[11,14]进行PPI网络构建,通过Cytoscape 3.7.2中的CytoHubba[15]筛选出核心治疗靶点。

1.1.6 富集分析利用ClusterProfiler R包[16]进行基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析,Org.Hs.eg.db包用于ID转换。GO分析主要包括生物过程(biological process,BP)和分子功能(molecular function,MF)及细胞组分(cellular component,CC),以P<0.05为筛选标准,选取前20条GO条目及KEGG信号通路进行可视化,并采用ggplot2包进行气泡图绘制。

1.2 结果

1.2.1 养肺方活性成分及靶点在TCMSP数据库中筛选出65个养肺方活性成分;通过ETCM数据库对活性成分靶点进行进一步预测,共获得283个药物靶点。

表1 养肺方治疗NSCLC有效药效成分信息

1.2.2 NSCLC差异基因分析运用GEO平台下载基因芯片GSE118370后,利用GEO2R归一化数据并分析差异基因,以|logFC|≥1且P<0.05为条件进行筛选,共获得差异基因1 192个,其中上调基因314个,下调基因878个。采用R包ggplot2[3.3.3版本]绘制差异基因的火山图、PCA图及热图。见图1。

注:A:基因归一化图;B:差异基因火山图;C:差异基因PCA图;D:差异基因热图。

1.2.3 WGCNA分析运用 WGCNA R studio函数(R包)构建共表达网络,软阈值β标准为R2>0.50,β=9,最终获得14个不同表达类型归纳的模块,grey模块被认为是无法被分配给任何模块的基因集合。以模块特征属性为基础,计算其与临床表型关联,发现darkgreen模块与吸烟表型的相关性最大,其中差异基因32个,相关系数为 0.94(P<0.01)。darkgreen模块与吸烟表型的相关性最大这一结果可同样通过模块-临床表型聚类分析获得,以|MM|>0.8及|GS|>0.1为筛选条件,对darkgreen模块中的32个核心基因进行筛选,共筛选出30个基因。将283个药物靶点与WGCNA筛选出的30个核心基因取交集,获得交集靶点基因10个。见图2。

注:A:标度独立性图;B:平均连通性图;C:模块特征向量聚类图;D:基因聚类图;E:模块与表型相关热图;F:样本聚类图;G:GS与MM相关散点图;H:差异基因图;I:养肺方靶点及核心差异基因韦恩图。

1.2.4 “药物-成分-靶点”网络利用Cytoscape软件构建 “药物-成分-靶点”相互作用关系网络,见图3,该网络包括359个节点和933条边,其中靶基因节点283个,活性成分节点65个。

图3 “药物-成分-靶点”网络图

1.2.5 PPI网络将10个交集靶点导入STRING网络平台构建PPI网络,该网络共有8个节点及19条边,下载网络文件导入Cytoscape软件进行可视化,运用CytoHubba计算核心靶点,选取Degree值前5位的靶点,得到核心靶点基因为IL-6、PPARG、TP53、MAPK14、CASP9。见图4。

图4 PPI网络图及核心靶点图

1.2.6 富集分析将10个基因利用ClusterProfiler包[17]进行KEGG和GO分析,P<0.05作为筛选标准,共筛选出869个BP条目,70个MF条目(未能富集出符合标准的细胞组分)及82个KEGG富集条目,前20个条目见图5。BP主要涉及对炎症反应的调节作用(regulation of inflammatory response)、类固醇激素反应(response to steroid hormone)、细胞对环境刺激的反应(cellular response to environmental stimulus)、白细胞凋亡过程(leukocyte apoptotic process)等;MF主要涉及磷酸酶结合(phosphatase binding)、蛋白磷酸酶结合(protein phosphatase binding)、泛素-样蛋白连接酶结合(ubiquitin-like protein ligase binding)、泛素蛋白连接酶结合(ubiquitin protein ligase binding)及RNA聚合酶II转录因子结合(RNA polymerase II transcription factor binding)等;KEGG富集通路主要为Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、Notch信号通路(Notch signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)等。

注:A:GO富集分析BP条目气泡图;B:GO富集分析MF条目气泡图;C:KEGG富集分析气泡图。

2 基于PI3K/AKT通路研究养肺方对NSCLC PC9细胞凋亡的影响

2.1 材料

2.1.1 动物与细胞人肺腺癌PC9细胞株(浙江美森细胞科技有限公司,货号:CTCC-400-0185)。Wistar大鼠,雄性,40只,体质量为(200±20)g,购自斯贝福生物技术有限公司,许可证号为SCXK(京)2019-0010。Wistar大鼠购回后饲养于北京中医药大学东方医院实验动物中心SPF级动物房,饲养条件:温度(24±2) ℃,湿度50%±10%,标准饲料喂养,自由进食水,昼夜12 h交替。本次实验得到北京中医药大学东方医院实验动物伦理委员会批准,伦理审查号为202020。

2.1.2 药物与试剂养肺方(颗粒剂,北京康仁堂药业有限公司)。胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素/链霉素(美国GIBCO公司,货号:10099141、25200056、15140122);DMEM高糖培养基(美国 Hyclone公司,货号:SH30022.01);RIPA(强)裂解液(上海碧云天生物技术有限公司,货号:P0013K);BCA蛋白定量试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司,货号:KGP902);Reveraid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司,货号:K1622);SYBR qPCR SuPerMixPlus试剂盒(苏州近岸蛋白质科技股份有限公司,货号:E096-01a);NucleoZol RNA提取试剂(基因科技公司,货号:740404.6);Tunel检测试剂盒(北京基谱生物科技有限公司公司,货号:GPB1829);p-蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司,货号:4060);p-磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)多克隆抗体(美国Abcam公司,货号:ab182651);山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG(美国Proteintech公司,货号:30000-0-AP、SA00001-1)。

2.1.3 仪器荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司,型号:ABI7300);小型垂直电泳转印系统(美国 BIO-RAD公司,型号:1658033);多功能酶标仪(美国MD公司,型号:MK3)。

2.2 方法

2.2.1 含药血清制备党参15 g,天冬12 g,麦冬15 g,五味子6 g,浙贝母12 g,清半夏15 g,细辛 3 g,干姜6 g,竹茹9 g,三七6 g,桔梗9 g,颗粒冲泡,制成浓度为40 g·mL-1的药液。适应性喂养大鼠3 d,随机分为养肺方组和空白组,每组20只。养肺方组大鼠每日灌胃养肺方溶液,空白组大鼠每日灌胃蒸馏水,每日灌胃2次,灌胃体积为10 mL·kg-1,连续灌胃7 d,最后1次灌胃1 h后腹主动脉取血,末次给药灌胃前一晚禁食不禁水。腹主动脉取血离心灭菌后获得含药血清。

2.2.2 细胞培养PC9培养条件为37 ℃、5%CO2,根据实验安排将细胞随机分为对照组及养肺方组。完全培养基含10%胎牛血清或不同比例含药血清及1%青霉素/链霉素。待细胞生长90%～100%时以13比例传代。取对数生长期的细胞进行实验。

2.2.3 细胞活力测定将PC9细胞接种到96孔板中,每孔5 000个细胞,每组设置3个重复孔,并设空孔组。培养12 h后细胞分别用不同浓度含药血清(20%空白组大鼠血清、2.5%含药大鼠血清+17.5%空白组大鼠血清、5%含药大鼠血清+15%空白组大鼠血清、10%含药大鼠血清+10%空白组大鼠血清、15%含药大鼠血清+5%空白组大鼠血清、20%含药大鼠血清)的培养基处理。在处理24 h后,弃培养基,并向每个孔中加入含10 μL CCK8试剂的新鲜培养基100 μL。继续培养4 h后采用酶标仪检测每组细胞在450 nm处的光密度(optical density,OD)值,计算各组细胞的细胞活力。细胞活力(%)=[(实验组OD值-空白孔OD值)/(对照组OD值-空白孔OD值)]×100%[17]。

2.2.4 蛋白质免疫印迹分析细胞分为对照(20%空白组大鼠血清)组及养肺方组(10%含药大鼠血清+10%空白组大鼠血清),培养于6孔板中。给药完毕后,将裂解溶液加入孔中以收集样品。在12 000×g,4 ℃离心20 min后采用BCA蛋白浓度测定法测定各样本蛋白浓度,依据测定结果将所有样本总蛋白浓度统一调至1 g·L-1。100 ℃高温煮沸10 min使蛋白变性以便于保存。SDS-PAGE电泳,取10 μL样本上样,80 V恒压电泳,条带至底部时停止电泳,100 mA恒流电转100 min,已完成电泳电转的PVDF膜加入快速封闭液封闭30 min结合PVDF膜上无关蛋白反应位点,加入11 000、12 000 稀释的p-PI3K、p-AKT一抗工作液及15 000 稀释的GAPDH 4 ℃过夜,加入15 000 稀释的山羊抗兔(鼠)二抗室温孵育1 h,超敏ECL发光液孵育后显影,ImageJ软件分析条带灰度值。

2.2.5 实时定量荧光PCR分析细胞分为对照组(20%空白组大鼠血清)及养肺方组(10%含药大鼠血清+10%空白组大鼠血清)。总RNA提取及浓度测定依据NucleoZol RNA提取试剂说明书完成。反转录获得cDNA后进行扩增,扩增反应体系为2×NovoStart®SYBR qPCR SμperMix Plμs 10μL,上下游引物各1 μL,模版cDNA 1 μL,ROX I 0.4 μL,RNase Free Water 6.6 μL。使用ABI 7300 qRT-PCR系统检测相关mRNA的表达,反应条件:95 ℃ 1 min,95 ℃ 20 s,60 ℃ 1 min,共 40个循环,最后一步 60 ℃时记录荧光信号,依程序设定溶解曲线,按照 2-ΔΔCt计算mRNA的相对表达量。引物序列为:PI3K:上游引物:5′-ACTGAAGCAGATGTTGAACAAC-3′,下游引物:5′-CATCGATCATTTCCAAGTCCAC-3′;AKT:上游引物:5′-TGACCATGAACGAGTTTGAGTA-3′,下游引物:5′-GAGGATCTTCATGGCGTAGTAG-3′。β-ACTIN:上游引物:5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′,下游引物:5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′。

2.2.6 细胞凋亡检测细胞分为对照组(20%空白组大鼠血清)及养肺方组(10%含药大鼠血清+10%空白组大鼠血清)。分组给药后,收集细胞,制备细胞爬片,4%多聚甲醛固定,PBS漂洗后加入500 μL 透膜液,室温水平摇床孵育15 min。PBS漂洗后,滴加50 μL Tunel检测液37 ℃孵育5 min。弃去检测液,PBS漂洗,滴加50 μL Tunel试剂于湿盒内37 ℃孵育90 min。弃掉Tunel试剂,PBS漂洗,滴加50 μL FITC试剂工作液37 ℃避光孵育30min。PBS漂洗,爬片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂(含DAPI)封片。样本于荧光显微镜下观察,每个样本随机挑选3个视野,计算细胞总数及阳性细胞数。DAPI染出来的细胞核为蓝色,TUNEL阳性表达的细胞为绿色。

2.3 结果

2.3.1 CCK8结果各实验组PC9细胞经过 24 h 不同浓度养肺方含药血清干预后,与对照组比较,细胞活力明显下降(P<0.05),且不具有浓度依赖性,养肺方含药血清浓度为10%时,细胞活力最差,且具有统计学差异(P<0.05),因此后续实验选定养肺方组的药物干预方式为10%含药血清。见图6及表2。

图6 细胞活力图

表2 CCK8法检测细胞活力

2.3.2 养肺方降低PC9细胞PI3K及AKT表达并诱导细胞凋亡与对照组比较,养肺方组p-PI3K、p-AKT蛋白及PI3K、AKT的mRNA表达水平均降低,且差异具有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。见图7、表3及表4。与对照组比较,养肺方组TUNEL染色阳性细胞数增加(P<0.05)。见图8及表4。

图7 PI3K/AKT通路相关蛋白条带图

图8 细胞凋亡图

表3 PI3K、AKT蛋白及mRNA表达水平比较

表4 两组细胞凋亡率比较

3 讨论

肺癌为难治性、高发性、高致死性的一类恶性肿瘤,主要治疗手段仍为外科手术联合放、化疗,然而放化疗在杀灭肿瘤细胞、控制与缩小肿瘤的同时,其严重的毒副反应常给患者带来极大的痛苦,且有效率仍不理想,使患者身心受到严重的打击。因此,在保证一定生存质量的前提下,寻求有效延长生存期的治疗方案尤为迫切。前期临床研究表明,养肺方联合治疗可延长患者生存期,改善临床症状并有效提高生存质量,然其作用机制尚不明晰。故本研究选用人肺腺癌细胞株PC9探讨养肺方抑制NSCLC发展的机制。

肺癌在中医中属于“积病”“癥瘕”等范畴,治疗时可以扶正益气、化痰散结、养阴生津为基本治则,王沛教授以沙参麦冬汤为基础方进行加减化裁,以益气养阴为基础,佐以扶正化痰之品,最终形成以党参、麦冬、天冬、五味子、干姜、细辛、清半夏、浙贝母、竹茹、桔梗、三七粉为主要成分的养肺方。方中党参味甘、性平,主归脾、肺二经,具有补脾益肺、养阴生津之效,补而不燥故为君药。麦冬、天冬甘寒质润,主入肺经,与党参同用增润肺生津之效、清甘补之燥烈,故为臣药。五味子酸甘性温,主入肺、肾、心经,为补虚强壮收涩之要药,上可敛肺止咳、下可固肾平喘、内能生津安神、外能固表止汗,与党参、麦冬、天冬相合则津液得生、诸气得复,正气存内而邪不可干;癌多为痰、瘀互结而成,故予半夏燥湿化痰、消痞散结,浙贝母清热化痰、解毒散结,竹茹清热化痰、止咳平喘以增强化痰散结之力;然而痰邪久羁最易耗气伤血,故纯用散痰消积之品唯恐耗伤肺气,取张仲景“病痰饮者,当以温药和之”的治疗原则,以干姜、细辛温化痰饮又合五味子以敛肺止咳平喘,则痰饮消、咳喘止、肺气不伤;三七粉活血而不耗气、止血而不留瘀;诸药相合共奏化痰散结、止咳化瘀之效,共为佐药。桔梗以其升散之力载诸药上行,主归肺经引诸药入肺,又有宣肺化痰之效,故为佐使药。半夏、贝母、三七均被证明有较好的抗肿瘤疗效,然作用机制繁杂,据此本研究先以加权基因共表达联合网络药理学挖掘养肺方治疗NSCLC的机制,进而进行体外实验验证。

通过挖掘养肺方活性成分及靶点发现,除中药中常见成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、黄芩苷等发挥作用,薯蓣皂苷元、金合欢素及人参皂苷 Rh2同样作为主要活性成分发挥重要药理作用,可以抗血管生成、抑制肿瘤细胞侵袭迁移、抗肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡,且主要通过PI3K/AKT信号通路发挥相关作用[18-23]。核心靶点IL-6、PPARG、TP53、MAPK14、CASP9。IL-6、MAPK14、CASP9的高表达与NSCLC的不良预后密切相关[24-26],PPARG、TP53的高表达被证明可抑制NSCLC的发生发展[27-28]。

通过对交集靶点的KEGG富集分析发现,主要包括PI3K/AKT、Wnt、Notch、MAPK等通路,其中PI3K/AKT通路不仅对肿瘤细胞的增殖凋亡、侵袭迁移起到重要作用,并且可以干预上下游靶点或通路以促进肿瘤细胞的增殖及相关药物耐药,靶向PI3K/AKT通路的药物部分已被批准于临床使用,并取得一定疗效[29-31]。在肺腺癌中,IL-6被认为可能是PI3K/AKT通路的上游因子,抑制IL-6/PI3K/AKT信号通路可以抑制肺腺癌细胞的增殖[32]。刘晓丽等[33]研究发现,沉默TP53基因表达可介导PI3K/PTEN/AKT信号通路从而抑制肾透明细胞癌侵袭转移。Verma等[34]研究发现,MAPK/RAS/RAF/MEK/ERK、PI3K/Akt/mTOR及PPARG下游靶点具有相互串扰的作用。MAPK及PI3K/AKT信号通路在肿瘤中起到协同作用,PI3K/AKT通路的高表达可以激活MAPK通路[35]。PI3K/AKT通路可以诱导糖原合成激酶-3β(GSK-3β)磷酸化[36],磷酸化的GSK-3β可以与β-catenin结合并促进Wnt/β-catenin通路的激活,进而促进肺癌的发生发展并诱导上皮间充质转化[37]。在NSCLC中Notch1和Notch3的激活突变会促进肿瘤的发生发展及诱导转移,同时抑制P53的表达从而抑制肿瘤细胞凋亡,Notch信号中的细胞内结构域(NICD)则可以在细胞质或细胞核内与AKT、Wnt等途径相互作用,以调节靶基因的转录[38]。由此推断,PI3K/AKT通路为本研究富集通路中的关键通路,故本研究针对PI3K/AKT通路,应用PC9细胞,初步验证养肺方抗非小细胞肺癌的作用机制。结合PI3K/AKT通路可以串扰其他相关通路及诱导肿瘤细胞凋亡的作用,推测养肺方可能通过抑制PI3K/AKT通路诱导细胞凋亡。

综上所述,养肺方治疗NSCLC的主要成分分别为槲皮素、山柰酚、木犀草素、黄芩苷、薯蓣皂苷元、金合欢素及人参皂苷 Rh2,主要靶点为IL-6、PPARG、TP53、MAPK14、CASP9,主要通路包括PI3K/AKT、Wnt、Notch、MAPK等通路。体外实验证明养肺方可以抑制NSCLC PC9细胞活性,并可能通过抑制PI3K/AKT通路诱导肿瘤细胞凋亡。NSCLC的发生发展为多条信号通路的协同串扰作用,并涉及多种细胞因子,本研究初步检测养肺方发挥抑癌作用的关键通路,后续仍需进一步检测养肺方化合物并分析有效成分,并深入探析相关信号通路间的机制,进一步探究癌细胞凋亡机制,依次验证活性成分-预测靶点-预测细胞通路的分子机制,并进行体内验证。