不同采收期对‘野酿2 号’毛葡萄酒理化特性及香气成分的影响

黄 竟，黄 羽，曹慕明，陈国品，黄秋凤，李 玮，谢蜀豫，管敬喜

（广西壮族自治区农业科学院葡萄与葡萄酒研究所，广西南宁 530007）

香气是评价葡萄酒的重要感官品质指标之一，葡萄酒中的香气成分种类、含量、性质及相互之间的平衡，决定了葡萄酒的风格和典型性[1]。葡萄酒中的香气成分不仅与发酵有关，还与葡萄的成熟度有关。果实成熟度是影响次生代谢物积累和决定品种特征的主要因素之一[2-3]。一般来说，葡萄收获时间仅由果汁糖含量和糖酸比决定。然而在温暖或气候炎热的地区，影响葡萄采收时间的因素可能更多，通常会造成早采或仅达到糖成熟而采摘，因此香气和风味的潜力不能得到充分的体现和表达。

在恰当的时间采摘葡萄，则葡萄酒具有优雅平衡的香气，早采可能会导致葡萄酒生青味过重，晚采可能会造成葡萄酒香气损失[4]。翟婉丽等[5]以杨凌地区‘媚丽’葡萄为材料，研究其采收期对葡萄酒质量的影响，结果显示相比8 月19 日和8 月28 日葡萄酿造的葡萄酒，8 月24 日葡萄酒香气总含量高，香气种类更丰富。段雪荣等[6]对昌黎地区成熟度17.0～22.0°Brix 的赤霞珠所酿的葡萄酒香气进行了分析，发现当糖度为20.6°Brix 时酒中香气成分总量最高且随着原料成熟逐渐增加，所酿酒中萜烯醇和去甲类异戊二烯化合物含量增加，果香和花香特征更为明显。Gambuti 等[7]的研究表明，未成熟艾格尼科（Aglianico）葡萄酿造的葡萄酒具有红色水果、草本、黑胡椒、芦笋和烟草的香味，葡萄成熟后的葡萄酒中含有大量的樱桃、草莓和烟草香气，过熟葡萄酿造的葡萄酒则具有洋蓟、黑胡椒、樱桃、蓝莓、李子、紫罗兰和茶等香气特征。

毛葡萄（Vitis quinquangularisRehd.）属真葡萄亚属（Euvitis）东亚种群，原产于我国，广泛分布于黄河以南的各省区。在广西毛葡萄较集中地分布在桂中、桂北、桂西的岩溶地貌地区。‘野酿2 号’是由广西农业科学院选育的两性花野生毛葡萄优良品种，该品种耐旱耐瘠抗病力强，同时对南方高温高湿气候适应性较好，现已在广西大面积种植，并成为酿造毛葡萄酒的主要原料[8]。然而受传统观念及气候因素影响，毛葡萄通常在着色完成或部分完成时就进行采摘，远未达到充分成熟的状态，导致毛葡萄酒偏酸且香气特征以生青味、泥土味、肥皂味等不良气味为主[9-10]，影响了毛葡萄酒应有的品质。为此本研究以广西罗城‘野酿2 号’毛葡萄为研究对象，在监测常规指标的基础上，采用气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）进行毛葡萄酒挥发性组分的检测，并采用内标标准曲线法对检出组分进行准确定量，结合香气活性值（odor activity values，OAV）分析的方法，探究不同采收期‘野酿2 号’毛葡萄酒香气变化情况，以期为酿制优质毛葡萄酒提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

‘野酿2 号’毛葡萄样品 采自广西罗城县金秋农业有限公司毛葡萄基地；硫酸铜 分析纯，天津市申泰化学试剂有限公司；酒石酸钾钠、氯化钾 分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；偏重亚硫酸钾分析纯，天津市福晨化学试剂厂；氢氧化钠 分析纯，天津市化学试剂公司；磷酸 分析纯，无锡市亚泰联合化工有限公司；盐酸 分析纯，无锡市亚盛化工有限公司；葡萄糖、磷钼酸、钨酸钠、没食子酸、单宁酸、乙酸 分析纯，天津市大茂化学试剂厂；三水和乙酸钠 分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；柠檬酸钠 分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；芦丁、酒石酸、L-苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和乳酸色谱纯标准品，美国Sigma 公司；挥发性化合物标准品、C6～C24正构烷烃 美国Sigma-Aldrich 公司；K1 活性干酵母 法国莱蒙特公司。

1260A 高效液相色谱仪、6890 GC 气相色谱与5975C MS 质谱联用设备 美国Agilent 公司；DVB/CAR/PDMS 顶空固相微萃取纤维头 美国Supelco 公司；HP-INNOwax 气相色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm） 美国J&W Scientific 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 采样 2021 年，根据广西罗城历年的采收时间及气候条件选取8 月15 日作为常规采收时间进行采样，然后分别于20 和40 d 后进行采样，后两次因天气等原因采收时间实际为9 月10 日（延迟26 d）、9 月23 日（延迟39 d）。

1.2.2 葡萄酒酿造 毛葡萄酒酿造参考小容器发酵法[11]，发酵容器为30 L 不锈钢罐，发酵酵母为K1 活性干酵母，添加量为200 mg/L，发酵温度20～25 ℃，SO2浓度为60 mg/L。发酵结束后进行倒灌并于15～20 ℃密闭贮藏3 个月，取澄清汁测定葡萄酒的理化指标和香气成分。

1.2.3 葡萄与葡萄酒理化指标的测定 总糖：斐林试剂滴定法（葡萄糖计）；酒精度：酒精计法；总酸：NaOH 滴定法（酒石酸计）；挥发酸：水蒸汽蒸馏法（醋酸计）；总酚：福林-肖卡试剂法（以没食子酸计）；单宁：福林-丹尼斯试剂法（以单宁酸计）；有机酸：液相色谱法，以上理化指标检测方法参考自《葡萄酒分析检验》[12]。总花色苷检测采用pH 示差法[13]；总类黄酮检测采用芦丁法[14]。

1.2.4 毛葡萄酒香气成分检测方法 采用顶空固相微萃取（head space solid-phase micro extraction，HSSPME） 与气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）相结合进行挥发性组分分析，具体方法参考文献[15-17]。

顶空-固相微萃取条件：在20 mL 样品瓶中准确加入1.00 g NaCl、5 mL 样品、10 μL 4-甲基-2-戊醇水溶液（内标，1.0088 g/L）和转子，在40 ℃条件下加热30 min，同时以500 r/min 转速进行搅拌；将已活化的萃取纤维头插入样品瓶的顶空，40 ℃条件下加热30 min。每个样品三次重复。

GC-MS 条件：气相色谱与质谱联用设备载气为氦气（He），流速为1 mL/min；进样口温度为250 ℃，解吸时间8 min，采用不分流模式进样；程序升温设定为初始温度50 ℃，保持1 min；以3 ℃/min 升至220 ℃，保持5 min。离子源为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量为70 eV，质量扫描范围为30～350 m/z。辅助加热区温度、离子源温度和四极杆温度分别为250、230 和150 ℃。

挥发性成分的定性定量：定性分析，采用自动质谱退卷积定性系统（auto mass spectral deconvolution& identification system，AMDIS）解谱，利用峰质谱图、保留时间或保留指数，与标准品、美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）2011 标准谱库以及文献收录化合物的质谱信息进行匹配，进行化合物的定性分析。定量分析采用内标标准曲线法，对于已有标准品的挥发性组分利用其相应的标准曲线来进行定量，没有标准品的物质利用化学结构相似、碳原子数相近、官能团相似的香气标准品的标准曲线进行半定量。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0 软件进行数据处理，采用Origin 2017 软件进行制图。图、表中数据格式为：±SE，X 代表平均值，SE 为标准误差；同一行数据后不同字母表示同一指标不同采收期差异显著Duncan 多重比较（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同采收期对毛葡萄果实总糖和总酸的影响

由图1 可知，不同采收时期‘野酿2 号’毛葡萄果实中糖、酸相互间均存在显著差异（P＜0.05），随着采收时间的后移，果实中总糖含量逐渐升高，而总酸含量则逐渐下降，含量由8 月15 日的20.37 g/L 下降到9 月10 日的11.3 g/L 和9 月23 日的10.74 g/L，分别降低了44.5%和47.3%，可以看出适当的延迟采收可以降低毛葡萄果实的含酸量，有利于酿造质量较好的毛葡萄酒。

图1 不同采收时期毛葡萄糖、酸指标Fig.1 Sugar and acid of grapes collected at different harvest times

2.2 不同采收期对毛葡萄酒理化指标的影响

将不同时期采收的‘野酿2 号’毛葡萄酿造成干红毛葡萄酒并对其理化指标进行分析。由表1 可知随着采收时间的后移，毛葡萄所酿葡萄酒酒精度逐渐升高，总酸含量逐渐降低，相互间均存在显著性差异（P＜0.05），酒精度由3.65%vol 增加至6.89%vol；总酸从20.69 g/L 降低至10.59 g/L。毛葡萄酒中残糖含量逐渐下降，但相对所酿干红葡萄酒而言，残糖含量偏高，8 月15 日和9 月10 日采收的毛葡萄酒，残糖含量分别为8.25 和6.27 g/L，高于国标GB 15037 中≤4 g/L 的要求，这有可能是酿酒酵母在发酵过程中受到高有机酸、乙醇、pH、渗透压等胁迫而影响了其发酵性能[18-19]，造成糖发酵不彻底。葡萄果实中的酚类物质在发酵过程中通过皮渣浸渍作用进入到葡萄酒中，其中如花色苷、类黄酮、单宁等物质会对葡萄酒的色泽、口感、气味及陈酿潜力等产生重要影响[20]。毛葡萄酒中除花色苷含量呈现出先升高后略有下降的趋势外，总酚、单宁和总类黄酮含量则随着时间的推移，含量逐渐升高，相互间均存在差异显著（P＜0.05），总酚由807.65 mg/L 增加至1466.21 mg/L；单宁由985.68 mg/L 增加至1410.98 mg/L；类黄酮由116.13 mg/L 增加至202 mg/L。葡萄果实中的酚类物质组成和含量与成熟度有极大的相关性，且决定葡萄酒潜在的质量[21-22]，因此延迟采收有利于提高毛葡萄酒的酒体结构和品质。

表1 不同采收时间毛葡萄酒理化指标Table 1 Physiochemical indices of wines made from grapes collected at different harvest times

由表2 可知，‘野酿2 号’毛葡萄酒中有机酸主要是酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和乳酸，其中酒石酸和苹果酸是占比较高的有机酸，二者在3 个不同采收期毛葡萄酒有机酸含量的占比分别是97.39%、91.39%和73.95%。酒石酸是葡萄的特征酸，大部分以酒石酸盐的形式存在，随着酒精度的提高，酒石酸的溶解度逐渐下降。苹果酸也是主体酸，但易被同化降解[23]。在本研究中，随着采摘时间的后移，‘野酿2 号’毛葡萄酒中酒石酸逐渐减少，而苹果酸先大幅下降后略有上升，相互间均有显著性差异（P＜0.05），其中酒石酸由6731.89 mg/L 降至2866.45 mg/L，降幅达57.42%；苹果酸则由9707.29 mg/L 降至2778.74 mg/L 后又增至3247.28 mg/L；在不同采收期的毛葡萄酒中，乳酸增幅较大，由311.8 mg/L 增加至1919.75 mg/L，这有可能是酵母发酵代谢产生部分乳酸所致[24]；柠檬酸与琥珀酸在3 种毛葡萄酒中的含量均较低。酒石酸酸味生硬尖锐，很难被酵母代谢。苹果酸赋予酒体酸涩感，需要乳酸菌进一步将其转化，从而使葡萄酒口感更细腻柔和。乳酸口感柔和，酸味较低，对葡萄酒口感有正向作用[25]。因此，从毛葡萄酒有机酸总量及组成上来看，9 月23 日采摘的毛葡萄更有利于酿造酒体柔和的葡萄酒。

表2 不同采收时间毛葡萄酒有机酸含量Table 2 Concentrations of organic acids in wines at different harvest times

2.3 不同采收期对毛葡萄酒香气成分的影响

由表3 可知，不同时期采收的毛葡萄酒中共检测出香气物质89 种，包括22 种醇类、37 种酯类、7 种酸类、5 种醛类、5 种萜烯类及其他物质13 种，其中8 月15 日采摘组为80 种，香气总量为490325.7 μg/L；9 月10 日采摘组为87 种，香气总量为648676.07 μg/L；9 月23 日采摘组为87 种，香气总量为852370.83 μg/L。3 组样品在香气成分上的差异不明显，但在化合物的含量上存在显著差异（P＜0.05），并且随着采摘时间的推迟，相应的毛葡萄酒中香气物质的总含量逐渐升高。

表3 不同采收期毛葡萄酒香气成分（μg/L）Table 3 Aroma components of wines at different harvest times (μg/L)

2.3.1 高级醇类 高级醇（又称杂醇）一般指具有两个以上的碳原子的一元醇[26]，葡萄酒中的高级醇主要来源于酵母在酒精发酵过程中氨基酸或糖代谢的产物，如异丁醇、戊醇、异戊醇、己醇、辛醇、壬醇和苯乙醇等[27-28]。如表3 所示，3 个酒样中共检测出22 种高级醇类香气成分，其含量分别占各自酒样的73.11%、71.24%、68.93%，是所有香气物质中含量最高的一类香气物质，然而绝大多数醇类物质的浓度远低于其阈值，仅有异丁醇、异戊醇、3-甲硫基丙醇和苯乙醇的浓度高于其阈值。异丁醇和异戊醇具有酒精味，3-甲硫基丙醇具有烤土豆和蒜香味，苯乙醇带有玫瑰、蜂蜜香气[15]。随着采摘时间的延迟，‘野酿2 号’毛葡萄酒中醇类物质的总量明显升高，但几种主要醇类物质的变化各异，异戊醇呈升高趋势，异丁醇、3-甲硫基丙醇呈先升高后下降的趋势，苯乙醇呈先降低后升高趋势。（E）-3-己烯-1-醇、叶醇、1-辛烯-3-醇、正庚醇、辛醇等物质香气活性值较低（0.1＜OAV＜1），对毛葡萄酒香气的影响较小。当高级醇浓度低于300 mg/L 时会对葡萄酒的香气起到积极作用，而高于400 mg/L 时，会使葡萄酒香气失去平衡，产生负面影响[29-31]。本研究中3 个采摘时期的毛葡萄酒中高级醇含量均超过300 mg/L，延迟采收的毛葡萄酒高级醇含量更是超过400 mg/L，这可能是造成毛葡萄酒生青味、肥皂味等不良气味相对欧亚种葡萄酒过重的原因之一。

2.3.2 酯类 酯类物质是葡萄酒中最主要的一类挥发性芳香物质，是酵母发酵的副产物，可赋予酒体果香和花香[28]。由表3 可知，‘野酿2 号’毛葡萄酒中共检测到37 种酯类化合物，其中乙酯类21 种，且随着采摘时间越往后，酯类的含量越高，且不同采收期毛葡萄酒中酯类物质的含量存在显著差异（P＜0.05），分别是124173.83、175188.78、257812.27 μg/L。乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、3-羟基丁酸乙酯和乙酸异戊酯是其中含量比较高的酯类物质。本研究中，己酸乙酯、丁酸乙酯、肉桂酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、乙酸异戊酯和乙酸乙酯由于其较高的OAV 值，是‘野酿2 号’毛葡萄酒主要的香气成分，主要呈花香与果香风味。不同采收期的‘野酿2 号’毛葡萄酒中含量较高的酯类物质差异明显，8 月15 日中肉桂酸乙酯和3-苯丙酸乙酯的含量最高，9 月10 日中是乙酸乙酯和乙酸异戊酯，9 月23 日中是丁酸乙酯和己酸乙酯，这种含量和成分上的差异赋予毛葡萄酒不同的花、果香香气特征。

2.3.3 酸类 酸类物质是葡萄酒发酵过程中酵母代谢的副产物，其浓度主要取决于酒的初始成分和发酵条件[28]。由表3 可知，‘野酿2 号’毛葡萄酒中共检测出7 种脂肪酸，9 月10 日中的脂肪酸含量最高，为10041.42 μg/L，最低的是9 月23 日的5523.44 μg/L，8 月15 日的为6403.69 μg/L。丁酸、异戊酸、己酸、辛酸等脂肪酸的含量均超过其阈值，是影响毛葡萄酒风味的主要酸类物质。C6～C10脂肪酸对葡萄酒香气的平衡协调有很重要的作用[33]，当脂肪酸的含量超过20 mg/L 时，会给葡萄酒带来不愉快的脂肪味，含量在4～10 mg/L 时，会给予葡萄酒奶酪与奶油的香味[30]。本研究中除9 月10 日中脂肪酸含量略大于10 mg/L，8 月15 日和9 月23 日中的脂肪酸都在适量的范围内。异戊酸、己酸、辛酸由于较高的OAV值，是毛葡萄酒中重要的特征香气物质。

2.3.4 醛类 醛类物质通常是由酵母催化丙酮酸盐脱羧生成[34]。在不同采摘时期的‘野酿2 号’毛葡萄酒中共检测到5 种醛类化合物，且各毛葡萄酒中醛类化合物含量差异不明显（P＜0.05）均在1200 μg/L至1300 μg/L 之间。醛类物质在香气总含量种所占比例较低，但其中的苯甲醛和香草醛含量高于其阈值，二者能够赋予葡萄酒玫瑰花香和奶香等香气。

2.3.5 萜烯类 萜烯类化合物通常有花香、甜水果和柠檬味等气味，嗅觉阈值在0.05～0.09 μg/L，具有很高的香气活性[35]。由表3 可知，本研究中共检测到4 种萜烯类和1 种降异戊二烯类成分，分别是香茅醇、芳樟醇、α-松油醇、1,1,6 三甲基-1,2 二氢萘（TDN）和β-大马酮。葡萄酒中萜烯类化合物含量通常很低，但由于较低的阈值，它们可能会直接影响葡萄酒的香气特征[36]。在毛葡萄酒的检测中，具有较高香气活性值的萜烯类物质主要是β-大马酮、TDN、芳樟醇，它们分别具有烤苹果、煤油、玫瑰花等香气，在不同采摘时期的毛葡萄酒中含量差异显著（P＜0.05）。

2.3.6 其它 除上述物质外，本研究中还检测到多种酚类物质、苯乙烯、4-异丙基甲苯、4-羟基苯乙烯和（E）-玫瑰醚等成分。挥发性酚类物质在葡萄酒中的含量通常高于自身的感官阈值，从而极易影响和修饰葡萄酒的风味[15]。在毛葡萄酒中共检测到愈创木酚、苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚、间甲酚、丁香酚、4-乙基苯酚、3-乙基苯酚和异丁香酚8 种酚类物质，其中OAV＞1 仅有丁香酚，该物质有肉桂、丁香等气味。

2.4 香气活度值和毛葡萄酒香气轮廓

香气活性值（OVA）是表征葡萄酒中各香气成分对实际香气贡献大小的一种普遍方法，通常认定香气活度值大于1 的香气物质为活性香气物质[29-30]，但0.1≤OAV≤1 的物质对酒样总体香气也具有一定贡献[31]。根据OAV 值，共确定35 种关键呈香香气成分，详见表4。

表4 不同采收期毛葡萄酒关键香气成分香气活性值Table 4 Main aroma components of wines at different harvest times

参考Cai 等[32]的做法，依据相似的气味描述，将葡萄酒中的香气化合物分为9 个香气类型，并计算出每个类型的香气活性值总和。如图2 所示，通过对香气类型的分析表明，本研究中‘野酿2 号’毛葡萄酒的香气特征主要表现为果香味、花香味、焦糖味、化学味和脂肪味（∑OAV＞30），植物味对毛葡萄酒香气也具有一定贡献（13＞∑OAV＞6），而泥土味和烧烤味对毛葡萄酒整体香气的贡献相对较低（∑OAV＜1）。

图2 不同采收期毛葡萄酒各香气类型香气活性值Fig.2 Total OAVs (∑OAV) of aroma series in wines from different harvest times

由表4 可知，在构成‘野酿2 号’毛葡萄酒主要香气特征的成分中，异丁醇、异戊醇、3-甲硫基丙醇、苯乙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、肉桂酸乙酯、异戊酸、己酸、辛酸、苯乙醛、香兰素、β-大马酮、TDN 和丁香酚等香气成分其香气活性值（OAV）均超过了1，因而是‘野酿2 号’毛葡萄酒典型香气的主要贡献者。随着采摘时间的延迟，‘野酿2 号’毛葡萄酒除果香味逐渐增加，脂肪味逐渐降低外，花香味、植物味、焦糖味、化学味和泥土味则呈现先增加后下降的趋势，但烧烤味变化不明显。相比8 月15 日和9 月23 日，9 月10 日的毛葡萄酒具有更浓的花香味和焦糖味。8 月15 日的毛葡萄酒则由于异戊酸、辛酸等脂肪酸含量高而具有较浓的脂肪味；9 月23 日的毛葡萄酒除植物味、泥土味、烧烤味外，其余各类香气的活性值较为均衡。

3 结论

通过对广西罗城不同采收期‘野酿2 号’毛葡萄及其葡萄酒的比较研究表明随着采收期的延迟，毛葡萄果实的糖分逐步提高，而滴定酸大幅度降低。对于酿造的葡萄酒来说，随着采收期的后移，毛葡萄酒中的酒石酸、苹果酸、残糖等指标大幅下降，酒度、单宁、多酚和总类黄酮等物质呈增加趋势。在毛葡萄酒香气方面，采用HS-SPME-GC-MS 检测技术和香气活性值分析得出，延迟采收有助于增加毛葡萄酒香气物质的含量，9 月23 日采摘组的葡萄酒中香气物质含量最高，为852370.83 μg/L。醇类是毛葡萄酒最主要的香气成分，酯类次之，二者在3 种酒样中占比分别为98.43 %、98.25 % 、99.17 %；毛葡萄酒的主要香气类型以果香味、花香味、焦糖味、化学味和脂肪味为主，且不同采收期的毛葡萄酒香气特征差异明显，其中9 月10 日的毛葡萄酒具有更浓的花香味和焦糖味。因此适当延迟采收有利于酿造出酸度适宜、酒体结构感强且更多花果香味的毛葡萄酒。