新疆伊犁地区不同马场马腺疫病原菌的分离及鉴定

买占海，周 轲，沙娅·奴尔兰，魏彦明，况 玲

（1.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070；2.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；3.伊犁州动物疾病预防与控制中心，伊宁 835800）

马腺疫是由马链球菌引起的急性传染病，是造成全球马业福利和经济损失的主要原因，该疾病最早由Jordanus Ruffus报道的[1]，其发病特点为易造成0.5～2岁马驹发病，出现发热，流鼻涕和头颈部淋巴结脓肿。在严重的情况下，下颌或咽下淋巴结的肿胀可能会压迫呼吸道限制呼吸，其临床特征赋予了该病称“马腺疫”一词[2]，且康复后存在复发的可能性。目前，该病几乎在全世界呈现蔓延趋势[3]，直接影响马的生长、发育及繁殖，甚至严重阻碍了马产业的发展。

马链球菌兽疫亚种（Streptococcus.equisubsp.zooepidemicus,SEZ）和马亚种（Streptococcusequi subsp.equi,SEE）的病原菌是马属动物临床上分离率最高的两种型，而SEE是由SEZ变异而来的，其分类上与SEZ非常相近[4-5]。目前发现SEE和SEZ在基因学上具有92% DNA同源性[6]。纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）是一种大分子糖蛋白，存在于脊椎动物细胞外基质和体液中，与机体内的纤粘蛋白相结合[7]。链球菌产生几种附着在细菌细胞壁上的纤连蛋白结合蛋白，其fneB毒力基因被发现包含一个碱基缺失，这导致C端细胞壁锚定域的丢失，并产生分泌截短纤维连接蛋白结合蛋白FNE，增强了链球菌的入侵潜力。马链球菌还具有许多在动物链球菌中没有发现的噬菌体相关的细菌超抗原，这些超抗原被认为与MHC II类抗原和T细胞受体分子同时结合，刺激T细胞和免疫反应，随后释放IL1、IL2、TNF-β和IL6等促炎细胞因子导致炎症的发生，患畜出现发热、中性粒细胞增多和血浆纤维蛋白原增加[2]。fneB常作为菌体表面起黏附作用的毒力蛋白，现有研究表明，PCR技术可以检测fneB基因[8]。但到目前为止，国内关于SEE的fneB基因分子方面的研究鲜有报道。本研究对新疆伊犁地区SEE与SEZ进行分离株的分离和鉴定，并通过对患病马血常规指标的检测和统计分析，以期为新疆地区马链球菌疾病的科学防控、诊断提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 革兰氏快速染色液、pMD-19T、感受态细胞DH5α购自天根生化科技（北京）有限公司；2×TaqPCR Green Mix、ddH2O、DNA Marker购自TaKaRa公司；阳性SEE菌株N20和N25由新疆农业大学中兽医实验室保存菌株。

1.2 病料采集 新疆昭苏县某三个马场疑似发生马腺疫，采集临床特征具有精神沉郁，高烧，头颈部淋巴结肿大，食欲下降，大量流浆液性甚至黏液性鼻涕患病马驹的鼻拭子。首先将2根医用无菌棉签用装有2 mL高压灭菌的PBS液浸湿，深入患病马驹鼻腔内沾取鼻内分泌物，或者无菌采集破溃淋巴结脓汁，将采集好的鼻拭子样品从手接触部位折断后放入1.5 mL含PBS液的无菌EP管内，并做好标记。三个马场（A马场、B马场、C马场）采集鼻拭子和血样分别为14份（A1～A14）、10份（B1～B10）、14份（C1～C14），以及C马场2份颌下淋巴结破溃的脓汁，共40份；除患病马匹样品外，另在三个马场各采集5匹健康马的血样15份（D1-D15），健康马血清样品共53份。

1.3 细菌的分离与培养 分别吸取从临床采集的40份疑似患马腺疫的样品各200 μL，加至10 mL含有5%胎牛血清的THB液体培养基中，37℃、180 rpm恒温震荡培养24 h，在无菌操作台上吸取20 μL增菌液划线接种于5%绵羊鲜血琼脂培养基上，37℃恒温培养24 h。观察鲜血培养基上的菌落形态，用接种环挑出具有β溶血的单个菌落，在鲜血培养基上划线进行细菌的纯化，直至培养基上无杂菌。

1.4 形态学观察及生化鉴定 挑取1株纯化后稳定的β溶血单菌落，对其进行革兰氏染色并观察其形态特征；将PCR鉴定为阳性的菌株分别加至链球菌生化编码鉴定管中，观察各鉴定管的颜色变化，结合《链球菌生化编码鉴定手册（GYZ-12ST）》进行结果判定。

1.5 PCR扩增 根据NCBI收录SEE的4047个全基因组中fneB的基因序列，应用DNAStar设计其引物[9]，SEE菌株的PCR扩增序列和反应运行体系见表1[10]。PCR反应体系（25 μL）：Taq聚合酶预混染料（2×TaqPCR Green Mix）12.5 μL，上、下游引物各1 μL；细菌DNA模板2 μL，ddH2O补至25 μL。反应程序为：95℃预变性30 s；95℃变性30 s，49℃复性30 s，72℃延伸 90 s，共35个循环；72℃再延伸10 min。PCR扩增结束后，取6 μL反应产物在1×TAE缓冲液中、120 V恒压条件下电泳30 min，然后在EB染液中浸染15 min后，在凝胶成像系统上观察结果。

表1 本研究所用引物[10]Table 1 Primers used in this study[10]

1.6fneB基因的测序鉴定 根据胶回收试剂盒的操作说明回收PCR产物。PCR胶回收产物5 μL、SolutionⅠ 5 μL、pMD19-T 1 μL、Control Insert 3 μL混匀后16℃过夜连接，将连接产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.7 血涂片检查及血常规指标测定 采集疑似患病马匹血液，立即制备血液涂片：取1滴鲜血至载玻片上，将其推成舌状，在光镜下清晰可见红细胞不黏连，每匹马涂3张进行备用。用EDTA抗凝采血管采集5 mL血液，轻轻摇匀，使抗凝剂与血液充分混合均匀，留作血细胞分析待用。

1.8 数据分析 用SPSS 26.0统计软件对血常规数据进行独立样本检验分析，当P＜0.05时表示差异显著，具有统计学意义。试验结果以“平均值±标准误差”表示。

2 结果与讨论

马腺疫是最常见的马呼吸道疾病之一，病原菌为SEE，是一种革兰氏阳性的β溶血细菌[11]。该病在世界各地马属动物身上均有暴发，严重影响马匹健康和制约着马产业的发展，给养殖户及马场等企业造成了巨大的经济损失[12]。带菌马匹已被认定是维持病原体长期存在且容易造成感染的关键因素，其发病率高达100%，死亡率达10%[13-14]。病原菌通过病马咳嗽、脓汁等持续向外排毒，随后与健康马匹接触而被感染[15]。鼻咽拭子的微生物学和PCR筛查能够有效鉴定是否感染SEE，也可以通过血清学方法鉴定[16-17]，此外还可以应用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测全长SeM蛋白的血清抗体来进行诊断（http://www.idexx.com/equine/laboratory/sequi elisa/），但对于亚临床性疾病的诊断并不可靠[2]。

2.1 细菌的分离培养SEE菌株具有β溶血的特点也是初步鉴定马链球菌的手段之一，40份样品中分离出8株形态单一稳定的样品有溶血现象，其中7株呈β溶血，1株呈α溶血（图1）。细菌形态学观察可知，革兰氏染色镜检中6株为β溶血菌株呈蓝色链状排列的球菌（图2a），而另1株为β溶血菌株呈蓝色杆状（图2b）；α溶血的菌呈蓝色链状排列均为阳性（图2c）。将1株α溶血菌和7株β溶血菌送至北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司进行测序。通过链球菌生化鉴定管A203对7株呈阳性菌进行生化检测，结果见表2和图3。由于SEE含有溶血素，具有β溶血的特征，通过SEE不能发酵蕈糖（海藻糖）、乳糖或山梨醇，而SEZ通常能够发酵蕈糖、乳糖或山梨醇，因此很容易区分SEE和SEZ。但使用该方法分离和鉴定马链球菌非常耗时，从收到临床样本起至少需要48 h，而PCR技术能够有效避免细菌生化试验培养的不足，因此它不再是检测马链球菌或诊断马腺疫的金标准方法[18]。本研究通过分离出的7株马源链球菌是否发酵蕈糖、蔗糖或山梨醇，即可初步诊断7株菌的分型，结果只有分离株A13能够发酵蕈糖和蔗糖，其余菌均不能发酵蕈糖即可初步诊断分离株A13为SEZ，而其余6种菌为SEE，但需PCR进一步确定和测序分析其同源性。

图1 细菌在培养基上呈β溶血Fig.1 Bacteria were β-hemolytic on the midium

图2 革兰氏染色镜检结果Fig.2 Bacteria were β-hemolytic on the medium

图3 分离菌的生化鉴定结果Fig.3 Biochemical characters of bacteria

2.2fneB基因扩增和同源性分析 根据表1中的fneB引物，阳性对照菌为N20，对7株疑似SEE菌株进行PCR扩增，7株菌均在1428 bp处扩增出目的条带，回收7株菌胶回收产物连接并送测序（图4）。

图4 fneB基因扩增结果Fig.4 The PCR amplification of fneB gene

7株疑似SEE分离菌株源于A马场、C马场，对疑似的7株菌拼接后提交NCBI数据库比对与其相似度较高的序列并进行下载，利用MegAlign的Clustal W和GenBank登录的SEE同源性基因序列与7株分离株测序结果进行比较，其中6株菌之间的核苷酸和氨基酸同源性均高达90%～99%（图5，图6）；6株分离菌株与美国源马亚种（GenBank：CP021972.1）、瑞典源马亚种（GenBank：AY898649.2）核苷酸同源性最高，达96%～99%[9]；分离的6株菌株分别来源于A马场的A8菌株和C马场的C2、C6、C9、C14和C16共5株菌株，可能为SEE菌株，而另1株A马场的A13菌株与其余6株分离株的同源性为76%～85%，用BLAST对其序列进行分析，结果表明A13菌株与SEZ（H70）菌株的序列相似度为95%，该序列（GenBank登录号：FM204884.1），与SEE（ATCC 39506）的序列相似度为94%，该序列登录号为（GenBank：CP021972.1）。分离的6株菌株与SEE菌株聚为一支，分离株A13先与SEZ菌株聚为一支，然后伸展与SEE菌株聚为一支，并且遗传亲缘性较近，并根据生化反应中SEZ能发酵蕈糖和蔗糖等特点，分离株A13可能为SEZ菌株，见图7。7株分离菌株均以fneB基因为PCR靶基因，据Lannergård等[8]报道，以fneB基因为目的基因进行PCR检测，10株SEZ菌株中可以检测到3株SEE菌株，经细菌生化试验及PCR测序可知，A马场分离株A8菌株为SEE菌株，A13菌株为SEZ菌株，表明该马场的马腺疫疾病是由SEE和SEZ混合感染引起，而C马场分离到的5株菌C2、C6、C9、C14和C16生化反应结果及PCR检测均符合SEE菌株特点，表明该马场发生的马腺疫是由SEE引起。

图5 分离株fneB基因核苷酸同源性分析Fig.5 Isolates fneB gene of nucleic acid homology analysis

图7 分离株fneB基因系统发育树Fig.7 Isolates fneB gene of phylogenetic tree

2.3 血常规指标测定 为了排除干扰，选择已经确诊为链球菌感染患马的血样进行分析，与健康马相比，患病马的白细胞总数极显著升高，白细胞总数升高大多数见于细菌性疾病和炎症性疾病，如炭疽、腺疫、巴氏杆菌病、蜂窝织炎等，这与本实验结果相符合，患病马匹白细胞总数高于健康马。粒细胞数和淋巴细胞数显著升高，表明患马腺疫时以淋巴细胞和粒细胞的增多为主。淋巴细胞是重要的免疫活性细胞，增多常见于感染性疾病、急性传染病的恢复期及淋巴性白血病[19-20]。患病马的淋巴细胞数量增多推测可能与感染马颌下淋巴组织受损破坏有关，也不排除病马多处于恢复期而导致的淋巴细胞数量增多。单核细胞增多常见于急性感染性疾病，如结核病、布鲁菌病及某些霉菌感染和大多数伴有肉芽肿性反应的疾病，也见于疾病急性感染的恢复期，推测实验结果中单核细胞数目的升高与马腺疫疾病恢复期、新生肉芽肿的生成有关。患病马与健康马相比HCT升高，说明患病马可能有脱水的症状，导致血液浓缩，常见的血液浓缩的原因包括疾病感染和发热，马腺疫病程中有典型、持续的体温升高变化，可能是造成患马HCT高于健康马的主要原因之一。

2.4 血涂片检查 通过血涂片检查，可以观察到同视野中白细胞数目明显增加，尤其是中性粒细胞数目明显增加（图8A）；且出现核分叶明显，中性粒细胞过于成熟，呈核右移的现象（图8B）。

图8 血涂片检查Fig.8 Blood routine examination

本研究从新疆伊犁3个马场中分离出了7株马链球菌，通过同源性结果分析可知，其中6株为SEE菌株，而另1株为SEZ菌株，由此说明新疆伊犁地区存在SEE和SEZ的混合感染，今后需加强伊犁地区马腺疫疫病的防控。