非小细胞肺癌患者组织LETM1表达及价值分析

柴晓婧 蔡甜甜 邹龙

肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,其死亡率约占各类恶性肿瘤死亡率的23%以上[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常见的肺癌类型,约占肺癌发病率80%,极大威胁到人类的生命健康[2]。近年来放化疗、手术治疗及靶向治疗在非小细胞肺癌方面取得一定进步,改善了患者预后。但术后复发、转移、减毒增效及克服耐药等仍是影响患者预后的难题,因此寻找新的肿瘤标志物早期预测肺癌,制定针对性治疗方案,对改善患者预后具有重要意义。研究证实,肺癌的发生发展与信号通路传导及基因表达异常相关[3]。亮氨酸拉链EFhand结构域跨膜蛋白1(leucine zipper/leucine zipper/EF-hand-containing transmembrane protein 1,LETMI1)是一种线粒体蛋白,参与了线粒体代谢反应的调节。有报道称LETMI1通过抑制线粒体生成诱导Hela细胞凋亡,促进多种类型的肿瘤进展[4]。研究发现通过免疫组化法对多种恶性肿瘤患者肿瘤组织进行染色处理,发现LETMI1在胃癌、卵巢癌、食管癌组织中的呈高表达量,但是在非小细胞肺癌中仍不清楚[5]。因此,本研究比较非小细胞肺癌组织LETMI1表达与患者一般资料以及生存预后的关系,旨在为非小细胞肺癌的诊疗评估提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年6月至2021年6月接受肺叶切除术的102例非小细胞肺癌患者作为研究对象。纳入标准:(1)患者均为初次入院确诊,术前未接受放化疗治疗;(2)经病理学确诊为非小细胞肺癌;(3)癌旁组织切缘未发生肿瘤组织浸润;(4)围手术期间未发生其他严重并发症;(5)患者或家属签署知情同意书。排除标准:(1)临床资料不完整或中断随访者;(2)合并其他恶性肿瘤;(3)自身免疫功能缺陷、先天性心脏病或营养严重不良者;(4)其他组织的急慢性炎症患者。本研究经本院伦理委员会审核并批准。

1.2 方法

1.2.1 样本收集:将纳入本次研究的102例非小细胞肺癌患者术中同时切取癌组织和癌旁组织,癌组织距肿瘤切缘<1 cm,癌旁组织距肿瘤切缘≥2 cm。样本组织取出后立即液态氮中冷冻,置于-80℃冰箱保存待测。

1.2.2 免疫组织化学染色检测组织LETM1蛋白表达:采用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶法,取适量样本组织,中性甲醛固定,石蜡包埋并制成切片。组织切片二甲苯脱蜡,梯度洗脱,将柠檬酸钠粉末置入2 L的PBS溶液中制成抗原修复液,加热抗原修复,在加入3%H2O2孵育10 min。滴加兔抗LETM1(美国Abnova公司,1∶100),37℃孵育3 h或4℃冰箱中过夜。次日PBS缓冲液震荡冲洗3次,滴加通用型IgG抗体50～100 μg(武汉博士德生物工程公司)37℃孵育30 min;滴加50～100 μg DAB显色试剂(上海Gene Tech公司)溶液显色,复染、透明、封片。

1.2.3 结果判定:由两名病理科医生双盲阅片评估,采用半定量积分法进行结果判定。染色强度:无染色,阴性;淡黄色,1分;棕黄色,2分;棕褐色,3分。染色面积:无阳性细胞,0分;0～25%,1分;26%～50%,2分;>50%,3分;将染色强度积分×阳性细胞百分比作为最终积分。参考相关报道[6],LETM1<2分为低表达,LETM1≥2分为高表达。

1.2.4 临床资料收集:患者均行肺叶切除术,术后按照《中国临床肿瘤学会肺癌诊疗指南》[7]进行辅助放化疗。完成术后治疗后,患者定期门诊复查。收集患者复查结果,以死亡或失访作为研究随访终点。随访时间为确诊时间,终点日期为患者死亡日期或截止日期,本研究随访时间2022年6月。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色结果分析 LETM1蛋白表达主要定位于细胞核,阳性染色呈棕色颗粒;LETM1蛋白在癌组织中呈高表达,在癌旁组织绝大多数呈阴性表达或极低表达,非小细胞肺癌组织LETM1蛋白阳性表达率为57.9%(59/102),癌旁组织为10.8%(11/102),2者差异有统计学意义(χ2=50.108,P<0.001)。见图1。

癌旁组织

2.2 组织LETM1蛋白表达与非小细胞肺癌临床病理资料的关系 LETM1蛋白低表达组43例和高表达组59例,2组在分化程度、TNM分期、淋巴结转移的差异有统计学意义(P<0.05),其余临床指标2组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 组织LETM1蛋白表达与非小细胞肺癌临床病理资料的关系 例(%)

2.3 LETM1蛋白表达与非小细胞肺癌生存预后的关系 随访截止至2022年6月,LETM1蛋白高表达59例,术后总体生存期为(26.74±3.78)月;LETM1蛋白低表达43例,术后总体生存期为(43.76±5.46)个月;差异有统计学意义(Log rank=17.627,P<0.05)。见图2。

图2 LETM1蛋白表达与非小细胞肺癌生存预后的关系

2.4 非小细胞肺癌患者预后Cox单因素分析 单因素分析显示,分化程度、TNM分期、淋巴结转移、LETM1蛋白是影响患者生存期的主要因素(P<0.05)。见表2。

表2 非小细胞肺癌患者预后生存期Cox单因素分析

2.5 影响非小细胞肺癌患者预后Cox多因素分析 进一步Cox多因素分析显示,TNM分期、LETM1蛋白表达是影响非小细胞肺癌预后生存期的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 非小细胞肺癌患者预后生存期Cox多因素回归分析

3 讨论

近年来,肺癌发病率和死亡率逐年上升趋势,受到远处转移、局部侵袭及耐药等因素影响,其5年死亡率高居不下。迄今为止,笔者发现肺癌的发病机制至今尚未完全明确,但肿瘤的发生和进展是一个多基因、多信号通路的复杂病理生理过程。LETM1是一种高度保守的线粒体内膜蛋白,其表达异常可导致线粒体功能紊乱,并诱导肿瘤的发生和进展。LETM1可诱导正常细胞的坏死,与细胞内调节能量的亚细胞线粒体的量减少相关。研究发现LETM1蛋白在宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌在组织中呈高表达[8]。国内学者在胃癌、结肠癌的研究中同样发现LETM1作为重要原癌基因促进了肿瘤的发生发展[9]。LETM1蛋白高表达可诱导线粒体稳态功能障碍,致使整齐糖酵解,增加乳酸分泌,改变线粒体形态,影响疾病生理进程。周宝勇等[10]研究还发现上调或敲低LETM1表达导致HeLa细胞线粒体Ca2+活性增大或降低,提示LETM1与线粒体Ca2+释放紧密相关。已有研究证实LETM1作为一种线粒体内膜蛋白,在维持正常呼吸代谢功能发挥重要作用[11]。

本研究首次检测102例非小细胞肺癌患者癌组织和癌旁组织LETM1表达,其染色结果显示,LETM1表达定位于细胞核中,但非小细胞肺癌组织阳性表达率为57.9%,癌旁组织为42.1%; 并且LETM1高表达与分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关,提示高表达LETM1促使非小细胞肺癌浸润和转移能力增强。目前对LETM1在肿瘤中的应用尚处于初级阶段,有学者研究发现LETM1高表达可能通过减少单磷酸腺苷激酶活性和ATP的生成而影响肿瘤进程[12]。此外,线粒体靶向基因LETM1的高表达在H-ras12V肝癌动物模型中具有抗肿瘤作用[13],提示LETM1可作为基因治疗的潜力,为靶向治疗提供了一条新的思路。

一项关于三阴性乳腺癌的研究发现,LETM1蛋白高表达的10年生存期均显著低于低表达患者[14]。另有研究发现头颈部鳞状细胞癌患者LETM1蛋白表达与总生存期和无病生存期相关,LETM1蛋白高表达有助于头颈部鳞状细胞癌的早期预测[15]。为进一步证实LETM1蛋白在非小细胞肺癌病情进展中的作用,本研究分析了LETM1蛋白表达与非小细胞肺癌患者生存预后的关系,结果显示,LETM1蛋白表达是影响非小细胞肺癌生存预后的独立危险因素,LETM1蛋白高表达的非小细胞肺癌患者生存期显著缩短,提示LETM1蛋白的表达可作为非小细胞肺癌生存预后的指标之一。

综上所述,LETM1在非小细胞肺癌组织表达显著上调,与肿瘤的发生、发展密切相关,有作为评估非小细胞肺癌生存预后新型生物标志物的潜在价值。但是本研究样本量偏少,且仅为单中心研究,LETM1表达与非小细胞肺癌患者的关系仍需要大样本证实。