哮喘患儿血清CircZNF652的表达水平及其临床意义▲

荣会蓉 周金成 夏 思 杨 凡

(1 长江大学附属仙桃市第一人民医院儿科,湖北省仙桃市 433000;2 湖北省仙桃市仙桃职业学院医学院,湖北省仙桃市 433000;3 长江大学附属仙桃市第一人民医院内科,湖北省仙桃市 433000)

哮喘是一种临床上常见的慢性呼吸道疾病,儿童的肺功能发育尚未成熟,免疫功能尚不健全,因此哮喘在儿童中的发生风险较高[1]。近年来,儿童哮喘的发病率呈逐年上升趋势[2-3]。哮喘患儿主要症状为咳嗽、胸闷等,同时伴随喘息反复发作,长期反复的炎症刺激还可能会引起气道重塑及气道狭窄,严重影响患儿日常生活及健康[4-6]。哮喘的发病机制尚不十分明确,目前认为与遗传因素、环境因素、免疫功能等有关[7]。因此,积极探索儿童哮喘的发病机制,寻找相关治疗靶点对于改善哮喘患儿预后具有重要意义。环状RNA(circular RNA,CircRNA)是环状共价闭合环状非编码RNA,2013年Hansen等发现CircRNA可以通过靶向调控miRNA参与各种生理过程的调控[8],此后,CircRNA逐渐受到人们的重视。Circ锌指蛋白652(zinc finger protein 652,ZNF652)是CircRNA家族成员之一,其在炎症相关疾病中表达异常[9],推测其可能参与炎症反应过程。哮喘本质上是一种气道炎症反应,目前CircZNF652与哮喘的相关研究鲜有报告。因此,本研究探讨哮喘患儿血清CircZNF652表达水平及其临床意义,旨在为儿童哮喘的诊断及靶向治疗提供新方向。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年5月至2021年3月长江大学附属仙桃市第一人民医院收治的105例哮喘患儿作为观察组,年龄5～12(7.90±2.25)岁,男童57例、女童48例。纳入标准:(1)符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[10]中的相关诊断标准;(2)患儿配合度较好,患儿家属同意本研究并签署知情同意书。排除标准:(1)合并先天性心肺功能不全者;(2)合并肝、肾功能不全者;(3)合并其他过敏性疾病及免疫系统疾病者;(4)一个月内出现过呼吸道感染者。另选取同期在长江大学附属仙桃市第一人民医儿童保健科体检的80例健康儿童作为对照组,年龄6～12(8.24±2.37)岁,男童43例、女童37例。观察组与对照组儿童性别、年龄差异均无统计学意义(均P>0.05),具有可比性。本研究所有实验过程均符合《赫尔辛基宣言》相关要求,并经我院医学伦理委员会审核批准。

1.2 分组 根据观察组患儿的临床表现,依照《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[10]相关标准将观察组的105例哮喘患儿分为急性发作期组57例和慢性缓解期组48例,其中急性发作期组男童32例、女童25例,年龄5～11(7.85±2.22)岁;慢性缓解期组男童30例、女童18例,年龄5～12(7.96±2.29)岁。急性发作期组与慢性缓解期组的性别、年龄差异均无统计学意义(均P>0.05),具有可比性。

1.3 方法

1.3.1 样本采集:采集观察组入院第1天、对照组体检时晨起空腹的外周静脉血4 mL,3 000 r/min离心15 min,留取上清液,于-80 ℃条件下保存待检。

1.3.2 实时荧光定量PCR法检测血清CircZNF652的表达水平:取上清液,按照TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific,批号:10296010CN)的操作步骤分离、提取上清液中的总RNA,并检测其纯度和浓度,严格按照逆转录试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号:RP1105)的操作步骤合成cDNA。采用Bio-Rad T100型实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)检测各组样品,以GAPDH做内参,反应条件为95 ℃ 预变性30 s,95 ℃变性5 s、60 ℃退火20 s、68℃延伸15 s 35个循环。采用2-ΔΔCt方法计算CircZNF652的相对表达量。CircZNF652上游引物:5′-GGGCACAAACAGTTCATGTG-3′,下游引物:5′-TGCGTTTGAATGATTTTCCA-3′,引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.3 血清炎症因子水平检测:采用ELISA检测血清肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6表达水平(试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,批号:E-EL-H0109c、E-EL-H6156),严格按照说明书方法进行操作。

1.3.4 肺功能指标检测:由同一位医生操作,指导研究对象按照正确的步骤进行检测,记录观察组入院第1天、对照组体检时1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in one second,FEV1)、呼气峰值流速(peak expiratory flow,PEF)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC),计算FEV1/FVC值。肺功能指标检测重复3次,取平均值。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示,组间比较采用两独立样本t检验;计数资料以例数(%)表示,组间比较采用χ2检验;采用Pearson检验分析观察组血清CircZNF652表达水平与肺功能指标及血清TNF-α、IL-6表达水平的相关性;采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析血清CircZNF652表达水平对儿童哮喘的诊断价值,并计算ROC曲线下面积(area under the curve,AUC);采用多因素Logistic回归模型分析儿童哮喘急性发作的影响因素。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 观察组与对照组血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表达水平与肺功能指标的比较 观察组FEV1、PEF、FEV1/FVC值均低于对照组,而血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表达水平均高于对照组(均P<0.05)。见表1。

表1 观察组与对照组血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表达水平及肺功能指标的比较(x±s)

2.2 急性发作期组与慢性缓解期组血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表达水平及肺功能指标的比较 急性发作期组的FEV1、PEF、FEV1/FVC值均低于慢性缓解期组,而血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表达水平均高于慢性缓解期组(均P<0.05)。见表2。

表2 急性发作期组与慢性缓解期组血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表达水平及肺功能指标的比较(x±s)

2.3 观察组血清CircZNF652表达水平与肺功能指标及血清TNF-α、IL-6表达水平的相关性 Pearson相关性分析结果显示,观察组血清CircZNF652表达水平与FEV1、PEF、FEV1/FVC值均呈负相关,与血清TNF-α、IL-6表达水平均呈正相关(均P<0.05)。见表3。

表3 血清CircZNF652表达水平与肺功能指标及血清TNF-α、IL-6表达水平的相关性

2.4 血清CircZNF652表达水平对儿童哮喘的诊断价值 以是否哮喘作为状态变量(无哮喘=0,哮喘=1),以血清CircZNF652表达水平作为检验变量绘制ROC曲线。结果显示,血清CircZNF652表达水平诊断儿童哮喘的AUC为0.741(95%CI:0.671,0.802),灵敏度和特异度分别为75.24%、67.50%,最佳截断值为1.12。见图1。

图1 血清CircZNF652水平对儿童哮喘诊断价值的ROC曲线图

2.5 哮喘患儿急性发作的影响因素分析 以哮喘患儿哮喘发展期作为因变量(0=急性发作期,1=慢性缓解期),以FEV1、PEF、FEV1/FVC值及血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表达水平作为自变量进行多因素Logistic回归分析,结果显示,FEV1、PEF、FEV1/FVC值,以及血清TNF-α、IL-6、CircZNF652表达水平均是哮喘患儿急性发作的影响因素(均P<0.05)。见表4。

表4 多因素Logistic回归分析儿童哮喘急性发作的影响因素

3 讨 论

哮喘是儿童常见的一种慢性呼吸道疾病之一,是由多种炎症因子共同参与导致的变态反应性疾病[11-12],以持续性气道炎症、气道高反应为主要特征[13],患儿会出现反复咳嗽、呼吸困难等临床表现,严重影响患儿的生活质量。由于呼吸系统处于高敏状态,哮喘患儿气道极易受到外界因素的影响[14],诱发哮喘急性发作,严重时可危及生命。哮喘的发病机制十分复杂,受多种因素的影响,若能尽早评估哮喘发生的风险,及时采取早期预防手段,将极大地降低高风险儿童哮喘的发病率,具有重要的临床意义。

血清生物学分子标志物是近年来疾病研究的热点,其能够客观快速地反映疾病进程,这为哮喘的早期诊断及靶向治疗提供了新的研究方向。目前仍无特异性较强的血清生物学分子标志物用于诊断早期哮喘的发生,因此寻找与哮喘相关的血清生物学分子标志物具有重要的临床意义。CircRNA是近年来新发现的非编码RNA,许多研究已经报告了CircRNA作为血清生物学分子标志物用于诊断疾病具有巨大的潜力,但目前相关研究多集中在肿瘤领域[15-16]。例如,CircRNA-100367被发现能够增强抗辐射的食管鳞状细胞癌细胞(KYSE-150R)的抗放射性,促进KYSE-150R细胞的生长,促进食管癌进展[17];CircWHSC1在子宫内膜癌组织中表达上调,能够促进子宫内膜癌细胞的增殖和侵袭[18]。研究表明,CircRNA与支气管哮喘具有密切的关系,CircRNA可以通过参与先天免疫应答过程和调控支气管上皮的炎症反应过程来调节支气管哮喘的发病过程,CircRNA为哮喘的早期诊断提供了新的研究思路[19],但不同的刺激源、不同的CircRNA会对支气管上皮炎症反应发挥不同的作用,具体的作用机制还需更深入的研究。

CircZNF652是最新发现的一类CircRNA分子,Liu等[20]发现下调CircZNF652的表达可以缓解脂多糖诱导的炎症损伤,提示CircZNF652可能参与炎症反应的调控过程。本研究结果显示,观察组血清CircZNF652表达水平高于对照组(P<0.05),与Wang等[21]的研究结果一致,提示CircZNF652可能参与儿童哮喘的发病过程。本研究结果显示,急性发作期组患儿的血清CircZNF652表达水平高于慢性缓解期组(P<0.05),提示血清CircZNF652表达水平与儿童哮喘的疾病发展期具有一定的相关性。本研究Pearson相关性分析结果显示,哮喘患儿血清CircZNF652表达水平与FEV1、PEF、FEV1/FVC值均呈负相关,与血清TNF-α、IL-6表达水平均呈正相关,而FEV1、PEF、FEV1/FVC值及血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表达水平均是哮喘患儿急性发作的影响因素(均P<0.05),提示临床监测肺功能和血清CircZNF652、TNF-α、IL-6表达水平对哮喘患儿病情判定、疾病发展具有重要意义。本研究ROC曲线分析结果显示,血清CircZNF652表达水平诊断儿童哮喘的AUC为0.741,灵敏度和特异度分别为75.24%、67.50%,提示CircZNF652表达水平诊断的效能良好,当血清CircZNF652表达水平>1.12时,应采取合理的防治措施,预防儿童出现哮喘症状。目前关于CircZNF652在哮喘发病过程中的作用机制尚不完全清楚,Wang等[21]认为CircZNF652的作用机制可能是通过充当miR-452-5p的海绵体并激活miR-452-5p/酪氨酸激酶2的信号通路及转录激活因子6信号通路促进杯状细胞化生,导致气道阻塞,进而诱发哮喘,但具体的作用机制还有待更深入的研究。

肺功能检测对哮喘的诊断、鉴别、病情严重程度评估、治疗效果判断及预后起着重要作用,也是临床诊断儿童哮喘的重要指标。FEV1反映中央气道的气流流速,PEF反映大气道流速,二者均能评估哮喘患者未来不良事件的发生风险;FEV1/FVC值是临床医生判断哮喘严重程度的重要因素,有研究证实FEV1/FVC值每下降5%,受试者哮喘严重程度表型可能会增加2.36倍[22-24]。另外,炎症因子表达水平升高也能增加气道炎症,容易出现气道管壁增厚、管腔狭窄,增加气道外周阻力,促进哮喘的发展[25]。许惠娟等[26]发现,急性发作期哮喘患者FEV1、PEF、FEV1/FVC值低于缓解期患者和健康受试者,且哮喘患者血清IL-33表达水平高于健康受试者。本研究结果显示,观察组FEV1、PEF、FEV1/FVC值均低于对照组(均P<0.05),而血清TNF-α、IL-6表达水平均高于对照组(均P<0.05);急性发作期组患儿的FEV1、PEF、FEV1/FVC值均低于慢性缓解期组(均P<0.05),而血清TNF-α、IL-6表达水平均高于慢性缓解期组(均P<0.05),这一研究结果与许惠娟等[26]研究结果相似。

综上所述,哮喘患儿血清CircZNF652表达上调,并与哮喘急性发作相关,且血清CircZNF652表达水平与肺功能指标呈负相关,与血清TNF-α及IL-6表达水平呈正相关,因此检测血清CircZNF652表达水平有助于哮喘患儿的病情判定,但其具体作用机制尚不十分明确,今后还需增加样本量、延长观察时间,并开展多中心的深入研究。